近日，江苏大学附属人民医院在《msystems》期刊发表最新研究成果！本研究对从中国江苏省镇江市分离得到的八株非伤寒沙门氏菌（NTS）进行illumina和Nanopore测序，旨在分析这些菌的流行病学特征及其耐药基因（AMR）的水平转移机制，为从遗传学角度预防和控制镇江市NTS耐药性提供理论依据。
本研究的测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
非伤寒沙门氏菌（NTS）是一种革兰氏阴性、兼性厌氧、不产孢杆菌，属于肠杆菌科，是全球最常见的急性胃肠炎病原体之一。大多数由NTS引起的人类胃肠炎病例是自限性的腹泻疾病，不需要使用抗生素治疗。但随着抗生素的过度使用和选择压力以及人类不合理使用抗菌药物，NTS出现耐药性变得加速。NTS耐药性主要由与酶修饰、能量依赖性外排、靶点保护和细菌细胞壁变化相关的耐药基因介导。因此，有必要研究NTS的耐药基因组成和分布，以减缓AMR的发展。
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实验材料
8株引起人类急性胃肠炎的NTS菌株
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测序平台
Illumina Novaseq+Nanopore
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分析内容
细菌基因组完成图、cgMLST分析、质粒复制子类型分析、血清型分析等
NTS菌株特征描述
总共收集了153份疑似急性食源性胃肠炎患者的标本，并从中分离出了来自8名患者的8株NTS。血清型分析表明，在这8株菌中鼠伤寒血清型最为普遍，其余菌株的血清型分别为Goldcoast、London、Enteritidis、Potsdam以及1,4,[5],12:i:−。
表1 血清型分析结果
NTS菌株的流行病学监测
基于cgMLST分型结果构建了一个包含13株沙门氏菌的最小生成树，三株鼠伤寒沙门氏菌ST19（XSK、CHC和ZCX）与从扬州市一名腹泻患者中分离出的鼠伤寒沙门氏菌ST34 YZU0175以及单相变种S. 1,4,[5],12:i:− ST34 ZLQ具有最近的进化关系。
图1 cgMLST聚类树图
耐药基因的组成和分布
测序共预测出76个获得性耐药基因，有40个位于质粒上，其余位于染色体上。耐药基因分别为AAC(6')-Iaa（10.5%）、TEM-1（7.9%）、sul2（6.6%）、tet(A)（5.3%）。耐药的抗生素类别为氨基糖苷类（30.3%）、磺胺类（13.2%）、β-内酰胺类和四环素类（各9.2%）。在8株NTS中检测到了耐药基因，其中CHC菌株拥有最多的耐药基因（17个），其次是FFL菌株（15个）、ZCX菌株（13个）以及XSK菌株（13个）。
图2 耐药基因组成和分布
耐药表型与耐药基因的相关性
药敏实验结果显示，表型抗性与已知的AMR决定因素的存在密切相关。在预测三类抗生素的耐药性方面，所检测到的耐药基因的整体灵敏度为100%（78.5%-100%），特异性为80%（49.0%-94.3%），Kappa值为0.8（0.4-1.0）。在这些基因中，与氨苄青霉素耐药相关的基因具有最强的预测耐药表型的能力。
质粒特征描述
在8株NTS中共检测到18个质粒，其中ZYX含有6个质粒、CHC和CYX各含有4个质粒、FFL以及ZCX各含有2个质粒。有6个被鉴定为可移动质粒，3个为接合质粒，其余为不可传递质粒。复制子分型分析显示，可移动质粒包括三个Col(pHAD28)质粒、两个Col440I质粒和一个ColRNAI质粒。接合质粒包括一个IncHI2质粒，一个IncFIB(S)质粒，以及一个IncI1-I(Alpha)质粒。在8个质粒中共鉴定了40个耐药基因，有12个基因在2个接合质粒上，其余基因则分布在6个不可传递质粒中。
携带耐药基因的MGEs在染色体上的分析
CHC、XSK和 ZLQ的染色体上共鉴定了11个携带耐药基因的移动遗传元件（MGEs），这些MGEs包括三个耐药岛、六个复合转座子和两个整合子。具体来说，CHC菌株染色体上携带了1个耐药岛、2个复合转座子和1个整合子，共有10个耐药基因位于这些MGEs中。CHC菌株染色体上还含有另一个由IS15DI侧翼包围的复合转座子，该转座子包含六个ISs和一个QnrS1基因。XSK菌株染色体上携带耐药基因的MGEs与CHC菌株相似，但多了一个tet(A)基因、一个IS（TnpA_TnAs1）以及位于耐药岛内的复合转座子中的另外三个基因。ZLQ菌株染色体上携带五个耐药基因，位于两个复合转座子上：其中一个包含四个耐药基因和五个ISs，另一个携带一个tet(B)基因和四个ISs。这些耐药基因及相关MGEs构成了耐药岛的主要结构。
图3 质粒和染色体上MGE分布情况
携带耐药基因的MGEs在质粒上的分析
在7个质粒上鉴定13个携带耐药基因的移动遗传元件，包括10个转座子和3个整合子。质粒中携带最多MGEs的是pFFL-2，其次是pZCX-1和pZYX-1。非移动质粒pCYX-1携带一个非复合转座子，包含一个TEM-1基因，而非移动质粒pCYX-2携带一个由Tn3和IS26侧翼包围的复合转座子，包含四个耐药基因。pFFL-2携带的14个耐药基因分布在3个复合转座子中，其中一个复合转座子内包含一个含有6个耐药基因的单一整合子。总共有10个插入序列（ISs）参与了这三个复合转座子的形成，其中IS26占据了60%。从ZCX菌株中分离出的两个接合质粒pZCX-1和pZCX-2分别含有三个和一个MGEs。pZCX-1的MGEs包括两个复合转座子和一个整合子，八个耐药基因分布在两个复合转座子中。pZCX-2中的MGE是一个复合转座子，携带四个耐药基因，包括两个由IS26侧翼包围的QnrS2基因，以及由IS15DI侧翼包围的OqxA和OqxB基因。pCHC-1上的复合转座子携带五个耐药基因，这些基因与鼠伤寒沙门氏菌CHC染色体上的那些不同。pZYX-1上的复合转座子携带一个整合子，包含三个耐药基因：dfrB4、qacE和sul1。
插入序列（ISs）的组成和分布
在8株NTS中总共鉴定了277个ISs，其中211个位于染色体上，66个位于质粒上。检出率最高的ISs是ISEch5，其次是IS26（11.2%）、ISEhe3和ISSen1。ISEch5和ISSen1仅在染色体上检测到，而在质粒上检出率最高的IS是IS26。在277个ISs中，25%参与了复合转座子的形成，包括染色体上的38个ISs和质粒上的32个ISs。其中，IS26是最常见的构成复合转座子的IS，其次是IS15DI和ISKpn26。
图4 ISs的组成和分布
ICEs和IMEs鉴定
ZLQ菌株染色体上检测到一个长度为80,793 bp的ICE，由87个基因组成，包括24个与IV型分泌系统相关的基因、2个编码relaxase的基因、1个编码整合酶的基因、1个编码耦合蛋白至IV型接合蛋白复合物的基因，以及59个编码其他蛋白质的基因。在五株NTS中总共鉴定了五个整合或可移动元件（IMEs）：CHC、XSK、ZCX、YZY和FFL。每个IME都含有两个重要的基因，即编码整合酶和relaxase的基因，其中relaxase主要属于MobH家族。
图5 ICEs 和IMEs鉴定
前噬菌体分析
在8株NTS中总共检测到21个完整的前噬菌体区域，其中含有最多前噬菌体的分离株是ZLQ和ZCX，其次是ZYX、FFL和CYX（各三个），CHC（两个），以及YZY和XSK（各一个）。在这些完整的前噬菌体中，最常见的类型是Phage_Gifsy_2、Salmon_118970_sal3和Phage_Gifsy_1。
图6 噬菌体区鉴定
在本研究中，通过全基因组测序（WGS）结合生物信息学分析，鉴定了来自镇江市的8株NTS的AMR基因和移动遗传元件（MGEs）。鼠伤寒沙门氏菌ST19是镇江市非伤寒沙门氏菌病的主要原因，最常见的AMR基因包括AAC(6')-Iaa、TEM-1、sul2和tet(A)，这些基因主要通过质粒、复合转座子（Tns）和整合子进行水平基因转移。本研究受限于NTS的低检出率，尽管如此，本研究提供了综合信息，有助于更好地管理和预防镇江市NTS耐药性的传播。
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文章索引：
Liu H, Zheng L, Fan H, Pang J. 2024. Genomic analysis of antibiotic resistance genes and mobile genetic elements in eight strains of nontyphoid Salmonella. mSystems 9:e00586-24.
https://doi.org/10.1128/msystems.00586-24
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