单细胞产品大揭秘 | 一文带你选择适合自己的单细胞产品！

世界上没有两片相同的树叶，对于细胞来说也是一样。细胞与细胞之间也存在着异质性。这种异质性不仅体现在宏观形态上，比如相同组织中细胞的类型，状态和相互作用差异；也体现在遗传信息上，比如基因组信息及基因表达水平等差异。传统的转录组分析是使用批量RNA测序（bulk RNA-seq）进行的，测量的是细胞基因表达水平的平均值，非常容易丢失细胞异质性的信息，而单细胞转录组测序（scRNA seq）可以捕获单个细胞内的mRNA，就可以发现不同细胞之间的异质性与小群体细胞的重要功能，弥补了bulk RNA-seq的局限性。

 单细胞与传统转录组测序对比

近年来，单细胞转录组测序已经成为生命科学领域最火的测序技术，越来越受到科研工作者们的青睐。与此同时，单细胞产品的种类也越来越多，为广大科研工作者们的学术研究带来了更多的便利与可能性，但琳琅满目的产品也让科研工作者们不知该如何选择。

基于此，派森诺提供4种单细胞转录组测序和4种空间转录组测序产品供大家选择，涵盖了各种主流单细胞测序，满足了不同客户的不同测序需求。

派森诺单细胞空转技术平台

那我们应该如何根据自己的需求在这些单细胞、空转产品中选择适合自己的一款呢？下面小编的分享希望给大家带来一些思路。

派森诺单细胞转录组测序产品

3’端单细胞转录组测序是目前使用最广泛的单细胞测序产品，基于10x Genomics Chromium平台的微流控体系，核心原理是通过Ploy  T捕获含Ploy A尾的转录本，所以适用于所有含Ploy A尾的真核生物。

做3’端单细胞转录组测序，有两个关键点至关重要。第一，获得质量良好的单细胞悬液，这是提高测序质量的必要条件。但不同物种、不同样本类型的解离成功率相差巨大。经过多年的沉淀，派森诺对于样本解离已有丰富的项目经验。截至2024年派森诺单细胞平台已成功完成千例单细胞样本测序，不管是动物样本如血液、脑组织、脊髓、胰腺、肝脏、肾脏、肠、肺、视网膜等，还是植物样本如禾本科、十字花科、葫芦科等都不在话下。特别在如骨组织、胰腺、眼球、皮肤和植物原生质体等疑难样本方面，派森诺都有着丰富的成功解离经验。详情请看：（担心疑难样本做不了单细胞？先来问问派森诺）

目前派森诺正在举行疑难样品免费解离的活动，如果对样品是否能做单细胞测序有疑问，欢迎联系派森诺销售人员。

第二，细胞注释准确度。细胞注释结果决定了后续数据分析走向，所以注释结果对后续分析影响很大。目前，软件自动化细胞注释方法方便且系统化，但完全依赖于参考数据集，注释的结果并不是高置信度注释。为了提高细胞注释的高置信度，防止细胞类型的缺失或者比例异常，需要专业的人工注释。在人工注释中，不仅要对单个细胞的基因表达进行分析，还要对其细胞簇功能富集分析，一方面借助数据库已知的细胞类型marker基因列表，另一方面要查阅大量相关文献资料精准鉴定细胞类型，此过程需要专业的经验且花费大量的时间精力。所以，专业的人工注释目前是大家认可的细胞注释的金标准。派森诺拥有自己的人工注释团队，为您的注释结果保驾护航。

3’端转录组测序实验原理

5’端免疫组库目前适用于人和小鼠。免疫细胞针对纷繁复杂的入侵病原体的免疫反应，依赖于其高度多样性的抗原识别受体B细胞表面受体（BCR）和T细胞表面受体（TCR）。而V（D）J基因是编码BCR/TCR可变区的基因，可以通过基因重排产生多种BCR/TCR，使其可以适应多种抗原，满足机体特异性免疫的需求。

基于10×Genomics的单细胞测序系统，可以实现高通量的5’端单细胞转录组和V（D）J测序，通过微流控系统将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴中，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生带有barcode和UMI 信息的cDNA。破油之后，cDNA一分为二，后续同时进行基因表达和免疫组库的文库构建。其中TCR/BCR的V（D）J序列通过设计在C区的巢式引物进行PCR富集；而mRNA保留的是5’端的信息，测序后即可获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。

5’端免疫组库实验原理

染色质将大量的DNA压缩成细胞核，使只有一小部分的DNA可以在每个细胞内进行转录。10x Genomics可以在单细胞表观基因组学水平上揭示染色质可接近性。该方案通过快速高效的单细胞标记、测序和分析，可一次性获得成千上万个单细胞染色质谱，获得单细胞水平的染色质开放区域信息。

10x ATAC技术核心是油滴包裹的凝胶珠（GEM），每个凝胶珠都带有独特的寡核苷酸条形码序列，包含P5测序接头、10xBarcode序列、Read1N序列。Tn5酶孵育单细胞核悬液，Tn5转座酶可以渗透进入细胞核膜，在细胞核内完成基因组DNA开放区的切割。发生转座反应的DNA，包含不同大小的片段，在被转座酶处理后，细胞核中的基因组开放区已经被切碎，且被接上了特定的接头，以便和凝胶珠结合。在微流控芯片上将孵育好的单细胞核悬液与预混液、带有barcode的凝胶珠和分液油进行混合，将成千上万个细胞核分配到纳升级的GEM（Gel Beads-in-emulsion）中， 收集GEMs后，进行线性扩增，来自同一个细胞的DNA片段被标记上同一个barcode，随后破油纯化产物，构建可用于测序的NGS文库。

实验原理

与细胞一样，即使是同一个遗传背景下的微生物也存在异质性。在过去，微生物由于其转录本含量低、半衰期短、拷贝数低、原核生物无Ploy A尾、细胞膜和细胞壁厚且复杂等原因无法在高通量单细胞层面研究微生物的异质性。经过深入的探索与创新，派森诺在使用Tween 20透化细胞膜，溶菌酶溶解细胞壁，胞内rRNA去除试剂去除rRNA方面实现重大突破，再通过10x单细胞平台的微流控体系，使带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中， 用随机引物进行mRNA捕获，实现无polyA尾的mRNA模板转换，并以mRNA为模板反转成cDNA，进行建库测序。目前，派森诺也是唯一使用10x平台来做微生物单细胞转录组测序的公司，并成功将rRNA占比控制在7%以下。

微生物单细胞转录组测序数据结果-数据质控

微生物单细胞转录组测序原理

部分结果展示（大肠杆菌）

派森诺空间转录组测序产品

单细胞转录组测序虽然能够积累大量关于细胞类型特异性基因调控的信息，但它们在处理过程中破坏了原始组织结构，丢失了空间位置信息。而空间转录组学技术能够在保留样本空间位置信息的同时，采用测序技术获得基因表达数据，从而更全面、直观地分析组织结构。

单细胞转录组与空间转录组对比

目前，派森诺共有4种单细胞转录组产品供大家选择：

10x Visium空间转录组是将组织样本透化后，mRNA从组织渗透到空间基因表达玻片，再基于Ploy T 捕获mRNA的Ploy（A）尾，进行反转录合成cDNA后进行建库测序，其主要在含有空间barcode的玻片上完成。

10x Visium空间基因表达玻片每个捕获区域内包含约5000个55 µm直径的带有空间位置标签的圆形spot点，spot点之间间隔45 µm，所以其分辨率还未达到单细胞水平。

实验原理与实验流程

2022年底10x Genomics推出了针对人和小鼠的空间转录组测序方案-Visium CytAssist，打破了石蜡包埋（FFPE）样本不适合做高通量测序的刻板印象。

与10x Visium相同的是，CytAssist空间基因表达玻片每个捕获区域内同样包含5000个55µm直径的带有空间位置标签的圆形spot点，所以分辨率与 Visium相同。

                         基因表达玻片构造

与Visium不同的是， CytAssist是基于探针捕获的原理来进行mRNA捕获，基因检出率更加优秀。针对小鼠（2万个基因）和人（1.8万个基因）的基因数据库设计了探针，每一个基因（人和小鼠），都预先设计了一对probe（人基因3对，小鼠基因1对）以靶定RNA的特定序列。左端探针包含有read 2结构， 用以后续PCR扩增，右端探针包含有 poly（A）结构，用以后续被玻片上的序列结合。只有两段探针同时被杂交，探针才会进行连接，若只有一段被捕获，后续将无法完成建库，因此可以有效降低假阳性。之后mRNA模板降解，组织透化后，探针序列从组织原位中渗透出来，与玻片上的寡核苷酸序列发生互补杂交。最后携带空间 barcode的探针序列用于进行测序文库构建和测序。

实验原理

(3) 10x Visium Cytassist（HD）-更高分辨率的空间转录组测序

2024年年初，10x Genomics正式推出Visium HD技术，该技术将空间转录组测序技术正式推向单细胞分辨率时代。Visium  HD空间基因表达玻片每个捕获区域内包含1100万个2x2μm带有空间位置标签的小方格，小方格连续排列“无间隙”，实现全组织覆盖，更加还原组织的空间结构信息，获得数据可根据不同细胞大小选择合适的最小分析单位实现单细胞水平的空间组织结构分析（10×官方推荐合并为8μm × 8μm，也可以根据细胞大小调整分析单位）。

基因表达玻片结构

(4) Xenium-亚细胞水平的分辨率，真正的空间原位

10x Xenium是一款组织空间原位分析仪器，该仪器将单分子RNA检测与强大的光学元件、数据采集和解码技术相结合，能够以亚细胞分辨率在整张切片上快速检测RNA表达水平。该平台可以兼容新鲜冷冻（FF）组织和石蜡包埋（FFPE）组织。用户可以在多个预先设计好的基因 panel中进行选择，也可以为人类和小鼠设计附加的自定义pannel或独立的自定义pannel。