文章题目：Antibiotic resistance in European wastewater treatment plants mirrors the pattern of clinical antibiotic resistance prevalence
期刊：SCIENCE ADVANCES
发表时间：2019年3月
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研究背景
耐药菌（ARB）能够在一种或多种抗生素作用下存活。这些耐药菌不仅降低了传染病治疗的成功率，还给人类健康带来了巨大的社会及经济负担。ARB及其抗性基因正在全球范围内迅速传播，涉及人类、食物、动物、植物以及环境（如土壤、水和空气）等多个领域。世界卫生组织（WHO）发布的抗微生物药物耐药性全球行动计划旨在全面应对这一挑战，目标是在所有与人类相关的领域，包括环境层面，共同应对抗生素耐药性问题。监测和评估控制措施，并确定抗生素耐药性在地理或时间上的发展趋势，对于理解其对人类健康的影响至关重。尽管目前的临床监测工作已经能提供大量关于抗生素耐药性分布的信息，但对于环境中抗生素耐药性的相关数据仍然匮乏。因为用于人类、动物或食品的程序不适用于环境样本，所以实施可靠的环境抗生素耐药性监测工作将面临极大的挑战。城市污水处理厂（UWTPs）已成为抗生素耐药性从人类活动传播到环境（如淡水、土壤）的重要途径之一。
根据2017年的EAR-NET监测报告，2013年至2016年间，欧洲整体呈现出自北向南、自西向东的抗生素耐药性梯度分布趋势。在这个梯度中，抗生素耐药性逐渐增强，特别是针对革兰氏阴性菌。本研究旨在初步勾勒出抗生素耐药性的总体状况，并借助当地的定期监测计划，进行更为严谨的比较分析，以识别出可能由特定事件或地区特征引起的异常现象。
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研究思路
污水采样和收集：七个欧洲国家（葡萄牙、西班牙、爱尔兰、塞浦路斯、德国、芬兰和挪威），HAC：葡萄牙，西班牙，塞浦路斯，爱尔兰；LAC：德国， 芬兰，挪威。2015年初秋和2016年初春的三次采样活动中收集城市污水样本。在无菌烧瓶中收集1-2L的体积，并在4ºC下保存。所有样本都遵循相同的采样方法、样品处理和DNA提取方案。
DNA提取与处理：所有废水样品，通过无菌滤膜(孔隙率0.22 nm)，保存至- 80℃。根据PowerWater DNA试剂盒说明书，提取样本DNA。每份样本重复提取3次，以作备份，DNA被运送到密歇根州立大学。
Qpcr 阵列：除qPCR阵列包含384对引物集外，增加了16S rRNA、blaCTX-M、blaOXA、blaSHV、blaTEM、blaVIM、mecA、qnrSrtF11、sul1、tetM、vanA、mcr-1和intI1引物。qPCR阵列使用微流控SmartChip多样品纳米分点器将384个引物组和样品点样至5184反应孔芯片。所有实验样本使用相同384对引物，均进行3次技术重复。
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数据分析
用于选择用于分析的qPCR阵列数据的质量标准：(i)至少有两个重复的样品，(ii) DNA含量大于5 ng的样品，(iii) Ct≤27的定量。因为没有获得每个基因的校准曲线，qPCR阵列定量分析不支持基于每体积水的基因丰度的估计。然而，利用16S rRNA拷贝数，可以得到目的基因相对拷贝数。也可以使用内参基因和感兴趣基因的CT值计算其相对丰度，2(Ct reference gene – Ct target gene)。
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结果展示
图1：HAC和LAC进入物基因相对丰度。（A）抗生素抗性基因（B）可移动遗传因子。相比LAC国家而言，HAC国家大多数耐药类别相对丰度较高。可移动遗传因子差异也比较明显，和抗生素丰度相反，LAC 国家比HAC相对丰度高。
图2：HAC和LAC流出物基因相对丰度。（A）抗生素抗性基因（B）可移动遗传因子。流出物基因丰度结果显示，抗生素抗性基因和可移动遗传因子，HAC相对丰度显著较高；注:由于对进水废水取样的限制，缺少爱尔兰的数据。
图3：HAC和LAC国家之间，进水和出水之间ARG平均流行率的差异（正值表示减少，负值表示增加，*表示HAC和LAC减少值在统计上有显著差异）。在所有国家，观察到万古霉素耐药基因在治疗后略有富集，有时从低于检测限的水平转变为可量化的水平。此外，LAC国家，磺胺抗性基因略有富集。
图4：评估临床环境与所研究UWTP最终流出物之间可能存在相关性。结果显示，几种ARGs的相对丰度与大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌临床分离株的表型耐药发生率显著相关。
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总结
这是欧洲首次对废水进行全面的抗生素耐药性监测。虽然本次研究对象是欧洲地区少量的污水处理厂，但通过统一的标准进行南北梯度分析，我们的结论得到了有力的支撑。这些发现不仅揭示了临床和环境抗生素耐药性的紧密联系，也提醒我们在制定应对策略时，应充分考虑社会和气候等多方面因素，例如气温和降雨量。本研究揭示了监测对于抗菌素耐药性防护的必要性。传统的粪便检测方法或许并不能准确评估废水样本中的耐药水平。这项深入研究的又一项精彩成果就是我们有可能创造出更为简洁且经济实惠的监测方案。这些方案在大量数据的有力支持下，将能成为全球废水抗生素耐药性监测的有力基石。
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END
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