标题：How bacteria actively use passive physics to make biofilms
第一作者：Liraz Chai、Vasily Zaburdaev
通讯作者：Liraz Chai
第一单位：以色列耶路撒冷希伯来大学
期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
时间：10/2024
论文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2403842121
现代分子微生物学主要关注细菌生物膜形成过程中信号传递和基因调控的作用，而常常忽视胞外基质中发生的物理过程。本文以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为模型生物，提出了一种将胞外物理过程与生物膜形成相结合的新观点。通过分析生物膜的物质运输、玻璃化抗旱机制、液-液相分离、生物矿化等胞外物理过程，揭示了细菌如何利用这些物理过程来维持生物膜的形态、结构以及提升其对环境压力的适应能力。
1、细菌胞外物理过程促进生物膜的形成
本文将生物膜中的细胞外环境定义为驻留在细胞外部和表面的有机无机分子集合。当前研究多聚焦于控制生物膜形成的基因和分子，而其产生和分泌后在胞外环境发生的物理过程常被忽略，这是一个物理学与生物学的交叉领域。生物膜中的物理过程对于驱动发育、塑造形态、维持膜内环境平衡以及调控环境压力等非常重要；细胞与胞外环境相互作用，形成整体稳态，细菌生物膜与多细胞真核生物组织也具有一定程度的进化相似性。
图1 细菌生物膜的胞外物理过程
2、生物膜中的水
生物膜具有与水凝胶相近的特征。生物膜含有80-90%的水，其干重的80%来源于细胞外基质(ExtraCellular Matrix，ECM)的生物聚合物网络。ECM具有类似海绵的性质，脱水生物膜在加入水后可实现溶胀和再水合ECM的水溶胀并不会导致其完全溶解，这也表明基质聚合物可能是交联的。
生物膜利用ECM渗透膨胀的性质作为扩散机制。当膜内生物含量达到阈值，无法满足细胞的营养需求时，会促进细胞分泌更多ECM；ECM网络的扩大会使得更多水渗透流入以使细菌获得足量营养物质，而ECM的膨胀也会同时驱动菌群向营养更丰富的区域扩张。
生物膜通过胞外环境中的自由水进行扩散运输，扩散作用使得生物膜内产生局部微环境。其不仅适用于营养物质运输，也适用于细胞间信号传导等过程，最终产生数十微米左右的高度局部化微环境。
当距离为数百微米时，扩散运输无法满足细胞对养分的需求。即使营养物的缺少会引发ECM驱动的渗透膨胀，但这并不能使群落内部细胞也获得充足的营养。其中，浸没在水中的生物膜分离成散布在水流通道中的微结构；而暴露于空气的生物膜形成支持定向水运输的脉管样系统结构，即基于褶皱水通道的远途运输。
褶皱结构的差异性使得生物膜中心的蒸发量更高，产生压力梯度驱动通道中的水流向缺乏营养物的生物膜中心；生物膜蒸发的增强会使得水通量增加，给细胞带来更多营养，实验也观测到更多的生物量积累。不受细胞和ECM阻碍的水通道流速约为10μm/s，与浮游细菌的游泳速度相当。
图2 B.subtilis 生物膜中的水
（A）生物膜边缘皱纹的光学图像；（B）生物膜的SEM图像，显示出与水凝胶结构的相似性，其中细胞嵌入ECM的致密网络中；（C）在经历去水合和再水合循环的可渗透膜上生长的生物膜的图像；（D）包含水填充通道的生物膜褶皱的横截面；（E）生物膜表面温度的IR测量，其中较低的温度指示由于水蒸发而冷却。当覆盖有生物膜的培养皿时（左），蒸发非常少，当盖子打开时（右），蒸发是活跃的，并且在生物膜的脊处最高；（F）整个干燥和水合生物膜的特征X射线衍射图，峰值去卷积（虚线）显示，生物膜皱纹中26nm-1信号处的自由水的贡献在干燥生物膜中消失，但保留了19nm-1处的结合水信号（左），整个活生物膜的宏观区域中相应峰的强度分布（右）指示样品的部分逐渐干燥（红色=干燥，绿色=水合）和皱纹中较高的水信号。
3、液-液相分离(LLPS)
LLPS作为生物膜胞外分子的一般组织机制。LLPS是在某些浓度下，由于分子间的相互吸引，溶液中的不同蛋白质共凝聚成具有受控组成和专用功能的致密液滴相，又称“无膜细胞器”。这种液滴具有一定寿命，且在外界环境改变时可逆，通常认为不可逆聚集体是病理的指征。
例如，E.coli生物膜ECM的主要聚合成分卷曲纤维的形成：CsgA(主要原纤维亚基),CsgB(负责CsgA成核)和CsgF(辅助蛋白)。CsgF在分泌CsgA的细胞膜上形成相分离的液滴，CsgF液滴募集CsgB肽，其继而充当成核剂并促进CsgA组装成原纤维。
图3 生物膜中的液-液相分离
（A）细胞外LLPS的示意图。对于高于饱和度C>Csat的蛋白质浓度，在本体中发生相分离。对于较低浓度C<Csat，需要冷凝表面来使液滴成核。辅助蛋白可能在细胞表面形成这样的液滴，以促进纤维形成或覆盖纤维并驱动其分支;（B）大肠杆菌细胞（DNA以蓝色标记）的荧光图像，其在细胞外形成卷曲纤维。辅助蛋白CsgF在细胞表面形成液滴（品红色），其中模板蛋白CsgB使纤维组装成核;（C）枯草芽孢杆菌ECM中主要成纤维蛋白TasA形成原纤维的TEM图像（免疫金标记）;（D）枯草芽孢杆菌生物膜样品的AFM图像，显示细胞和明显的纤维，可能是TasA。
生物矿化是指生物体借助有机质沉淀矿物的过程，主要矿物为铁、镁、硅和钙等。
碳酸钙形成菱形方解石晶体作为最稳定的形态，而有机添加剂例如TapA存在时，其结构和形态会发生变化。生物体利用碳酸酐酶将二氧化碳转变为碳酸根与金属离子发生反应，结合不同金属离子的TasA胞外纤维显示出不同宏观形态，金属离子同时也可作为ECM组分的交联剂并导致基质组分的凝胶化，形成“金属矿化凝胶”。
另外，当钙离子浓度下降或生物膜老化时，金属离子会从ECM释放到其它结合物质(如孢子中的吡啶甲酸等)，这可能削弱ECM网络有助扩散。
图4 生物矿化作用
（A）碳酸钙形成菱形方解石晶体（SEM图像，左图）作为最稳定的形态。然而，结构和形态受到有机添加剂的存在的影响，例如TapA（SEM图像，右图）；（B）金属离子在生物膜中积累，如枯草芽孢杆菌生物膜的X射线荧光图谱所示，沿皱纹具有较高的锰信号；（C）TasA原纤维结合不同的金属离子，如X射线荧光所揭示的。不同的金属离子组成与宏观纤维形态相关；（D）当TasA纤维暴露于钙化条件时，它们可能被碳酸钙涂覆，如AFM下TasA纤维增厚所示。箭头指向我们怀疑涂有碳酸钙的TasA纤维。
总结
本文以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为模型生物，提出了细菌如何主动利用被动的物理过程来构建和维持生物膜的全新视角。通过探讨这些过程在分子、细胞乃至整个生物膜尺度上对膜结构和功能的影响，为理解细菌如何通过胞外物理过程形成复杂的多细胞结构提供了新的思路。
