文献阅读 | 利用Cas12a激活的环状DNA纳米结构拓扑屏障促进反应自催化并开发DNA/RNA系列传感器

文摘 2024-05-30 16:00 浙江

标题：Topological barrier to Cas12a activation by circular DNA nanostructures facilitates autocatalysis and transforms DNA/RNA sensing

第一作者：Fei Deng

通讯作者：Yi Li

第一单位：School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, University of New South Wales, Sydney, Australia

期刊：Nature Communications

时间：2024

论文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-46001-8

文章摘要

控制CRISPR/Cas12a的反式切割对生物传感器的发展至关重要。该研究证明了部分匹配gRNA序列的环状DNA纳米结构沉默Cas12a核糖核蛋白的切割活性，将该结构线性化可激活Cas12a。因此建立了一个自催化的Cas12a环状DNA扩增反应(AutoCAR)系统，该系统允许单个核酸靶标激活多个核糖核蛋白，并极大地提高了每个靶标引发的报告探针裂解率，以接近指数的速率产生信号。用荧光-猝灭基团修饰的DNA纳米结构同样具有自催化作用，在室温下可检测低至1 aM(<1 copy/μL，提高了10^6倍)的DNA，且不需要额外的扩增。靶标的检测浓度范围可覆盖3到11个数量级。在血浆中肿瘤DNA的SNP突变、基因组中的DNA(H. Pylori)和未经反转录的RNA(SARS-CoV-2)检测中，检测限都达到1 aM。开发了癌症突变的比色侧流试纸检测技术也可达到~100 aM的检测限。

主要内容

1、环状DNA纳米结构的构建与表征

针对CRISPR/Cas12a反应体系中的gRNA设计了环状DNA纳米结构，该结构包含蓝色的与gRNA互补的双链、黄色的PAM双链以及黑色的单链。当体系中存在靶标时，Cas12a与gRNA形成初始的核糖核蛋白并切断环状DNA中的黑色单链，该结构随即展开为线性，并激活更多的核糖核蛋白以产生更多的信号。由此开发了自催化Cas12a环状DNA扩增反应(Autocatalytic Cas12a Circular DNA Amplification Reaction，AutoCAR)。

图1 常规CRISPR/Cas12a反应原理和环状DNA纳米结构

蓝色序列与gRNA互补结合从而激活核糖核蛋白，其长度会影响激活效果。在线性结构中，27 nt长度能产生最佳的激活能力。而当该结构为环状时，几乎无法激活核糖核蛋白。以荧光值(环状)/荧光值(线性)为表征，发现该比值在蓝色序列长度为20 nt时最高，即环状结构的沉默效果和线性结构的激活效果相对最佳。

图2 不同长度的蓝色序列及结构对核糖核蛋白的沉默/激活效果

2、自催化Cas12a环状DNA扩增反应

在常规CRISPR/Cas12a体系中加入环状DNA，形成常规反应-自催化反应两级串联的AutoCAR。反应1 h产生的荧光信号相较于常规反应提升7.3倍，并且增加环状DNA的使用量可以进一步强化自催化效果。相较于常规反应荧光信号的线性增长，AutoCAR实现了近指数的信号增长趋势。

图3 AutoCAR原理及自催化反应效果

在加标样品的检测中，AutoCAR检出限低至0.6 copies/μL，并且在3个数量级范围内0.6-(600 copies/μL)呈良好线性关系(R2=0.96)。实际样品应用中，针对幽门螺杆菌(DNA)的检测限达1.4 copies/μL。常规的CRISPR/Cas12a几乎不能响应未逆转录的RNA靶标，但在SARS-CoV-2(RNA)样品的检测中，该方法检测限低至0.36 copies/μL，拓宽了Cas12a蛋白的应用。

图4 AutoCAR针对不同样品的检出限

3、针对多元化应用场景的AutoCAR延伸技术开发

为了简化反应体系开发了AutoCAR-2，该版本将前置常规反应体系移除，并用荧光-淬灭基团修饰环状DNA，以此实现自催化和信号产生的双重功能。改进后的体系更加简单可控，且在维持原有灵敏度的情况下将检测范围从3个数量级拓宽至6个数量级，适用于检测靶标浓度差异更大的样品。

图5 AutoCAR-2原理及检测范围

AutoCAR-3与AutoCAR类似，但以前述环状DNA荧光探针取代了体系中的单链荧光探针。该版本可在人血浆中检出0.6 copies/μL的靶标，且相较于常规反应可显著区分健康、直肠癌、x射线治疗组的小鼠。为了满足临床的快速检测，以抗原-抗体取代荧光-淬灭基团，结合侧流试纸开发AutoCAR-4，可定性检测低至29 copies/μL靶标浓度的小鼠样本。

图6 AutoCAR-3和-4的应用

总结

基于环状DNA纳米结构的自催化效应开发了CRISPR/Cas12a检测新方法—AutoCAR。该方法避开了常规CRISPR/Cas12a与前置扩增反应的不兼容性，以环状DNA的自催化实现信号放大，提高了稳定性和可控性。针对不同适用场景进行了多元化改进，开发出共4个版本，实现0.36-29 copies/μL 靶标的高灵敏检测。该研究对阻碍CRISPR/Cas检测技术发展的瓶颈问题进行了探究，为此类技术的开发和应用提供参考。

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来源|浙江大学环境微生物课题组

推文作者|孙凌涛

责任编辑|朱林

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