标题：TnpB homologues exapted from transposons are RNA-guided transcription factors
第一作者：Tanner Wiegand
通讯作者：Samuel H. Sternberg
第一单位：Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Columbia University, New York, NY, USA
期刊：Nature
时间：2024
论文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-07598-4
文章摘要
转座子中的tnpB和iscB基因编码由RNA引导的DNA核酸酶，通过DNA的靶向切割和同源重组促进自身传播。此类基因家族不断进化，导致多种CRISPR相关核酸酶的出现，如Cas9和Cas12。TnpB样核酸酶也可能具有适应性免疫之外的特殊功能。利用系统发生学、结构预测、比较基因组学和功能分析，在多个独立分支上发现了可编程转录因子，并将其命名为TnpB样核酸酶死亡抑制因子(TldRs)。这些蛋白利用向导RNA特异性地识别保守的启动子区域，产生类似于CRISPR技术的基因抑制效果。研究肠杆菌科中广泛存在的tldR进化支，发现噬菌体利用tldR和邻近基因改变宿主鞭毛组装相关蛋白的表达和组成，这有可能影响宿主的运动性、噬菌体敏感性和免疫力。该研究展示了转座子编码基因被反复驯化，并呈现了多样化的分子进化，揭示了转录因子TldR的进化轨迹。
主要内容
1、核酸酶失活TnpB蛋白筛查
TnpB蛋白的RuvC结构域赋予其核酸酶活性。该结构域由3个酸性残基(死亡效应因子，DED)组成，DED突变可能意味着新功能的获得。使用隐马尔可夫模型以50%序列同源性分析了95731个TnpB样蛋白，对RuvC活性位点DED的保守性进行了评估。从中筛查到的506个TnpB样蛋白具有1/2/3个残基突变，推测这可能会导致RuvC失活，并将这类TnpB样蛋白命名为TldR。AlphaFold预测进一步为RuvC活性位点的顺序退化提供了支持。TnpB/TldR折叠的其余部分或RNA结合界面没有突变，这表明由RNA引导的DNA靶向功能可能保留了下来。
图1 TnpB样蛋白系统发育树和RuvC结构域突变失活位点
常规tnpB位于IS200/IS605/IS607转座子家族，或与转座酶编码基因tnpA强关联，可以通过这些特征识别tnpB。tldR的基因组背景中缺乏tnpA和可识别的转座子末端序列，但与一些非转座子基因有很强的遗传关联，这些基因通常具有进化分支特异性。例如，肠杆菌的tldR与编码鞭毛蛋白亚基的fliC基因关联；肠球菌的tldR与编码ABC转运蛋系统的5-6个基因关联；梭菌的tldR与调节鞭毛亚基的csrA基因关联。该发现预示TldR蛋白可能参与鞭毛和ABC转运蛋白表达和/或调节。此外，fliC基因不仅由宿主自身携带，还可能存在来自原噬菌体的额外拷贝(fliCP)。
图2 不同进化分支的tldR与特定基因呈强遗传关联性
2、TldR蛋白的gRNA和TAM识别
tldR可能与tnpB类似，其相关的gRNA将在基因附近编码。用gRNA协方差模型扫描每个tldR基因侧翼的500 bp窗口后，确定了fliCP相关和oppF相关tldR的高置信度gRNA样序列。结合RNA测序数据发现tldR侧翼的假定gRNA大量表达。将假定gRNA序列克隆至E. coli进行RNA免疫沉淀测序，该序列呈现高测序覆盖度，表明gRNA被加工成熟并与TldR顺利结合。
图3 RNA-seq和RIP-seq证实gRNA的成熟加工
3、TldR作为转录因子抑制宿主基因表达
为了探究来自原噬菌体的fliCP-tldR的功能，使用BLAST比对识别该系统的潜在靶标。推断靶标为宿主fliC基因上游的启动子，假定靶标的侧翼是保守的GTTAT基序，该基序与TnpB蛋白识别的TAM基序高度相似。由此推断噬菌体编码的TldR-gRNA复合物通过靶向结合启动子抑制宿主fliC的表达。
图4 噬菌体fliCP-tldR的靶标和TAM序列
构建了同时携带fliCP-tldR (原噬菌体)和fliC(宿主)的E. coli菌株，与仅携带fliC的E. coli空白组对比验证。在所有携带tldR基因的菌株中，gRNA均大量表达。不携带原噬菌体的空白组菌株fliC正常表达；含原噬菌体的菌株中fliC被抑制，取而代之的是fliCP的正常表达。去掉TldR系统中的任意一个成分(gRNA/fliCp/tldR)会恢复宿主fliC的表达。进一步将fliCP-tldR转移到质粒上，仍能抑制宿主fliC表达。因此证实了TldR蛋白可以作为转录抑制因子实现免疫防御以外的新功能。
4、可编程的gRNA-TldR调节基因表达
为了证实TldR的RuvC结构域突变是否确实导致其核酸酶失活，构建了gRNA-tldR/tnpB质粒，将特异性靶标插入卡那霉素抗性质粒，将这两种质粒一同克隆至E. coli。由于TnpB的核酸酶活性破坏了卡那霉素ARG，导致抗性平板上生长的菌落显著减少。TldR组的菌落数量与空白组基本一致，证实了TldR确实已经丧失核酸酶活性。
图6 TnpB和TldR核酸酶活对比
gRNA-TldR具有可编程化抑制基因表达的潜力。与前文方法类似，将搭载gRNA-tldR的质粒和搭载靶标-rfp(红色荧光蛋白编码基因)质粒一同克隆至 GFP(绿色荧光蛋白)工程菌株。靶向有义链的gRNA-TldR大幅下调了rfp的表达，使此类菌株几乎不产生红色荧光；靶向反义链的gRNA-TldR略微下调了rfp基因的表达，也在一定程度上削弱了红色荧光。证实了TldR可以在特殊设计的gRNA引导下调节基因表达，具有工程化应用的能力。
从TnpB同源物中发现了一类新蛋白TldR。RuvC结构域的突变导致TldR核酸酶失活，因此具有免疫防御以外的新功能。不同进化分支上的TldR与特定基因(filC、oppF、csrA)呈现强遗传关联。以filC-tldR为例预测并证实了其gRNA、TAM的位置和结构特征。filC-tldR系统中的gRNA靶向filC基因上游的启动子，可作为转录因子调节基因表达。证实了由原噬菌体携带的filCP-tldR通过抑制宿主filC表达影响宿主鞭毛组装过程。基于filC-tldR设计了特异性靶向系统，在工程菌株上成功下调了红色荧光蛋白的表达，实现了该系统的可编程应用。
