中国农业大学刘军副教授等：植物乳杆菌1-9代谢水苏糖机制研究

植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)是一类在自然界中广泛分布的乳酸杆菌^[1],其中多种菌均可食用^[2]。植物乳杆菌常见于肠道中,可改善肠道微生物结构及组成,调节丙酮酸代谢能力,降低肠道pH值,提高机体免疫力,具有体内益生活性^[3-4]。目前,植物乳杆菌代谢碳水化合物的机制研究表明,植物乳杆菌基因组中含有丰富的编码碳水化合物代谢过程相关的酶类和所需蛋白的基因,在发酵过程中植物乳杆菌能够充分利用碳水化合物,产生短链脂肪酸等有机酸^[5-6]。植物乳杆菌对碳水化合物的利用具有菌株特异性及底物结构选择性^[7-8]。目前植物乳杆菌代谢功能性低聚糖的研究主要集中在低聚糖对植物乳杆菌的增殖作用以及其益生活性的应用,而益生菌和益生元的组合需要进行大量的筛选。因此,探究植物乳杆菌对碳水化合物的代谢机制,有利于迅速寻找特异性底物结构,发掘性能优异的益生菌与益生元组合。

水苏糖由2分子半乳糖、1分子葡萄糖和1分子果糖组成,这3种单糖均是常见的功能性低聚糖(低聚半乳糖、低聚果糖等)的单体,因此水苏糖可作为探究植物乳杆菌代谢碳水化合物的底物结构的特异性底物。此外,水苏糖本身也是一种具有良好益生特性的益生元,在人体胃肠道中可发挥多种生物活性:水苏糖不能被人体胃肠道消化吸收,可完整到达大肠部位进而被肠道菌群代谢;水苏糖具有润肠通便、增强肠道屏障功能并参与免疫缓解肝脏损伤^[9-13]等功效。目前尽管已有对1株植物乳杆菌代谢水苏糖机制的相关报道^[14],但是由于微生物底物代谢的菌株特异性及结构选择性差异,对于其代谢机制的相关研究仍需进一步补充和完善。

本研究从发酵羊乳中筛选分离得到1株植物乳杆菌1-9,拟通过监控其以水苏糖为唯一碳源条件下的生长曲线并分析代谢产物,观察该菌株对水苏糖的特异性代谢能力;并进一步采用薄层色谱法(thin-layer chromatography,TLC)监测发酵液中水苏糖的代谢历程,分析植物乳杆菌1-9代谢水苏糖的关键酶基因表达及酶活变化,探究植物乳杆菌1-9代谢水苏糖分子机制。研究旨在合理设计基于植物乳杆菌与水苏糖的益生组合及为相关产品开发提供理论参考。

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌ST-3,植物源功能食品北京市重点实验室保藏菌株。水苏糖,食品级,山东亿宝莱食品配料有限公司;牛肉浸粉、蛋白胨、酵母浸粉,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;四水合硫酸锰、七水合硫酸镁、磷酸氢二钾、乙醚、正丁醇、甲醇、乙酸,分析纯,国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖(glucose, Glu)、果糖(fructose, Fru)、半乳糖(galactose, Gal)、α-乳糖(α-lactose, α-lac)、无水乙酸钠、硫酸、磷酸、无水碳酸钠,分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;柠檬酸三铵、无水乙酸钠、吐温-80,分析纯,西陇化工股份有限公司;对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside, pNPG),分析纯,北京索莱宝科技有限公司;对硝基苯酚(p-nitrophenol, pNP),分析纯,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;琼脂糖,分析纯,北京百瑞极有限科技公司。水溶性脂肪酸混合标准溶液,色谱纯,北京北方伟业计量技术研究院;DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒,天根生化科技有限公司;qPCR预混试剂、Master qPCR Mix (SYBR Green I)试剂盒,北京擎科生物科技有限公司;MRS肉汤,生物试剂,北京奥博星生物技术有限责任公司。无糖MRS肉汤(g/L):牛肉浸粉8.0、蛋白胨10.0、酵母浸粉4.0、无水乙酸钠5.0、磷酸氢二钾2.0、柠檬酸三铵2.0、七水合硫酸镁0.2、四水合硫酸锰0.05、吐温-80 1.0,pH值为6.6,121 ℃灭菌 15 min;薄层层析板、GF254硅胶板,青岛海洋化工有限公司。

1.2 仪器与设备

Multiskan FC型酶标仪,赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;PTC-200型PCR仪、CFX96型荧光定量PCR仪,美国伯乐(Bio-Rad)公司;DYCP-31CN型电泳仪,北京六一生物科技有限公司;Nano-300型超微量分光光度,杭州奥盛仪器有限公司;DGU-20A型高效液相色谱仪,日本岛津(Shimadzu)公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株分子生物学的鉴定

取实验室以牛奶-甘油保藏的植物乳杆菌ST-3菌液及3株未知菌株菌液,在MRS肉汤中以5%接种量接种,37 ℃培养24 h,重复2次后作为种子液备用。对从发酵羊乳中通过MRS平板划线分离得到的菌株(记为菌株1-9、1-1-1、1-k-1)进行分子生物学鉴定。取活化后的种子液,采用DNA提取试剂盒法提取并获得细菌全基因组。使用细菌16S通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R (5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′) 对菌株序列进行扩增,获得长度约为1 600 bp的细菌16S rDNA,委托北京擎科生物科技有限公司进行16S rDNA测序。

1.3.2 植物乳杆菌代谢碳水化合物的菌株差异性及底物差异性测定

配制以葡萄糖、水苏糖为唯一碳源的MRS液体培养基,将活化的植物乳杆菌ST-3、菌株1-9、1-1-1、1-k-1 以5%接种量接种,37 ℃恒温静置培养,在0、3、5、7、9、12、24、27、30、36、48 h测定发酵液在 595 nm 波长下的吸光度(OD₅₉₅)。以时间为横坐标、吸光度为纵坐标,绘制4株菌代谢葡萄糖、水苏糖的生长曲线。

以相同的方式补充绘制菌株1-9以半乳糖、果糖、α-乳糖为唯一碳源的生长曲线。

1.3.3 菌株1-9代谢水苏糖产物测定

菌株1-9代谢水苏糖的过程中定时(0、3、5、7、9、12、24、27、30、36、48 h)取培养液并测定pH值,绘制pH值在代谢过程中的变化曲线。

参考李咏如等^[15]的方法并稍加修改,测定菌株1-9代谢水苏糖过程中发酵液中短链脂肪酸含量。使用无水乙醚萃取不同时间点发酵液中短链脂肪酸,采用高效液相色谱法分析短链脂肪酸种类和含量的变化。色谱条件:紫外检测器,Agilent ZORBAX 300SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm×5 μm),流动相A为甲醇,B为5 mmol/L磷酸盐溶液(pH=2.8),梯度洗脱程序为0～8 min,5% A;8～13 min,38% A;13～20 min,40% A;20～40 min,60% A;40～45 min,5% A。初始甲醇柱温40 ℃,流速1.0 mL/min,进样量10 μL,检测波长210 nm。

采用薄层色谱法分析菌株1-9代谢水苏糖过程中糖种类变化。取0.5 mL各时间点发酵液至离心管,12 000 r/min离心10 min后收集上清液。采用微量进样针吸取上清液(4 μL)后点样于薄层层析板,点样完成后将薄层层析板置于展开剂中展开2次,晾干后显色剂浸润,吹风机吹干后115 ℃条件下显色5 min。采用水苏糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、乳糖标准品以及无糖MRS培养基作为对照。展开剂中正丁醇、乙酸、水体积比为3∶2∶1,显色剂中硫酸、甲醇体积比为5∶95。

1.3.4 菌株1-9代谢水苏糖关键酶的基因表达情况测定

采用试剂盒提取并获得菌株1-9全基因组,委托上海派森诺生物科技有限公司进行细菌基因组框架构建及分析。通过NR、eggNOG、KEGG、Swiss-Prot、GO这5个数据库,对菌株1-9的蛋白编码基因进行功能注释,预测菌株1-9代谢水苏糖关键酶α-半乳糖苷酶的基因^[16]。

采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测预测代谢关键酶基因在代谢水苏糖过程中的表达情况。采用试剂盒提取菌株1-9在代谢水苏糖0、3、6、12、24 h时培养液的总RNA。采用qPCR预混试剂对菌株1-9 RNA进行反转录,合成cDNA第1条链,冻存于-80 ℃待用。利用Primer Premier 6设计内参基因与目的基因的引物序列,委托北京擎科生物科技有限公司进行合成。以该菌表达16S rRNA加工蛋白RimM的序列为内参基因。引物序列见表1。

表1 qPCR反应引物

Tab.1 Primer of qPCR

通过qPCR试剂盒法检测目的基因表达情况。反应条件:预变性95 ℃ 1 min;循环反应95 ℃ 10 s,60 ℃采集荧光信号30 s,循环40次;熔解曲线65 ℃ 5 s,至95 ℃。反应结束后记录循环数并进行计算分析,使用2^-ΔΔCT法计算表达差异量,其中ΔCt₁=Ct_空白目的-Ct_空白内参,ΔCt₂=Ct_实验目的-Ct_实验内参,ΔΔCT=ΔCt₁-ΔCt₂。当2^-ΔΔCT≥2时,认为基因是过量表达。空白组为使用MRS肉汤培养24 h的菌株1-9的总RNA。

1.3.5 菌株1-9代谢水苏糖上清液酶活力的测定

取0.5 mL各时间点发酵液至离心管,10 000 r/min离心10 min后收集上清液。滤膜(0.22 μm)过滤后测定上清液中α-半乳糖苷酶酶活力。96孔板中分别加入10、20、30 μL浓度为15 mmol/L pNPG底物,依次加入40、30、20 μL不同时间点过滤除菌的上清液并充分混匀,37 ℃恒温培养箱中孵育120 min后加入150 μL 2 mol/L Na₂CO₃ 溶液终止反应,405 nm波长条件下测定反应液的吸光度。配置浓度梯度为0、0.6、0.7、0.8 mmol/L的pNPG溶液,测定各标准溶液405 nm波长条件下的吸光度。以pNPG溶液浓度为横坐标,OD₄₀₅为纵坐标,绘制pNPG标准溶液浓度-吸光度的标准曲线(OD₄₀₅=0.228 6c+0.001 7,R²=0.996 2)。以先加入2 mol/L Na₂CO₃ 溶液,后加入过滤除菌的上清反应液为空白组。

α-半乳糖苷酶酶活力的计算见式(1)。

酶活力

(1)

式(1)中,酶活力为1 mL发酵上清液中含有的酶活力单位,1 min水解产生1 μmol pNPG所需要的酶量为1个酶活力单位,μmol/(min·mL)。120为测定条件下的反应时间,min。

2.1 菌株1-9分子生物学鉴定结果

采用分子生物学方法对实验室筛选分离的编号为1-9的菌株进行鉴定。16S rDNA测序后进行NCBI数据库BLAST序列比对并构建系统发育树,见图1。由图1可知,菌株1-9与植物乳杆菌2877(GenBank: MT611839.1)位于同一支,且16S rDNA序列相似度最高,达到99.93%。因此,鉴定菌株1-9为植物乳杆菌。其余实验所用菌株经16S rDNA测序比对后均鉴定为植物乳杆菌。

图1 菌株1-9的16S rDNA系统发育树

Fig.1 Phylogenetic tree of strain 1-9 based on 16S rDNA

2.2 植物乳杆菌1-9生长情况分析

在相同糖为唯一碳源的情况下,不同植物乳杆菌表现出不同的增殖情况,见图2。由图2可知,植物乳杆菌1-9表现出优异的碳水化合物特别是水苏糖代谢能力。发酵0～3 h,植物乳杆菌1-9在不同碳源上的生长均处于延滞期;发酵3 h后,以单糖(葡萄糖、半乳糖、果糖)为唯一碳源的发酵液中植物乳杆菌1-9进入对数生长期,以水苏糖为唯一碳源的植物乳杆菌1-9于发酵9 h后进入对数期,而植物乳杆菌1-9对于α-乳糖的代谢能力显著弱于单糖及水苏糖;发酵48 h后,以水苏糖为唯一碳源的植物乳杆菌1-9发酵液在595 nm波长下吸光度与单糖(葡萄糖、半乳糖、果糖)无显著差异,且显著高于α-乳糖。有研究表明,α-乳糖溶于水后构象发生改变,溶液中的乳糖为α-构象与β-构象的平衡,不利于植物乳杆菌1-9分泌α-半乳糖苷酶^[17]。

图2 不同碳源的植物乳杆菌生长情况

Fig.2 Growth of Lactiplantibacillus plantarum on different carbon sources

2.3 植物乳杆菌1-9代谢水苏糖过程中发酵液pH值的变化分析

在水苏糖为唯一碳源条件下,对植物乳杆菌1-9发酵液pH值变化进行监测,见图3。随着发酵时间的延长,发酵液pH值逐渐降低并最终趋于平稳。发酵0～9 h,发酵液pH值由6.84±0.10降低至6.24±0.07;发酵9～24 h,发酵液pH值迅速降低至4.00±0.03;24 h后至发酵结束,pH值始终保持平稳。植物乳杆菌1-9代谢水苏糖发酵液pH值变化与生长曲线变化相吻合,表明植物乳杆菌1-9发酵9 h后进入对数生长期,迅速代谢水苏糖,产生乳酸及短链脂肪酸等代谢产物,从而降低发酵液pH值。随着发酵时间的继续延长,植物乳杆菌1-9生长进入平台期,培养基中残余水苏糖逐渐减少。

图3 植物乳杆菌1-9代谢水苏糖过程中发酵液的pH值

Fig.3 pH of fermentation broth during stachyose metabolization by Lactiplantibacillus plantarum 1-9

2.4 植物乳杆菌1-9代谢水苏糖产短链脂肪酸的变化分析

短链脂肪酸是微生物代谢碳水化合物产生的主要产物,体外实验和体内实验都揭示了植物乳杆菌可代谢碳水化合物产生乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等短链脂肪酸^[18-19]。以水苏糖为唯一碳源,采用HPLC法分析植物乳杆菌1-9发酵液中短链脂肪酸组成及含量的变化,见图4。由图4可知,植物乳杆菌1-9代谢水苏糖主要产生乙酸、丙酸及戊酸。由于发酵培养基中存在乙酸钠,导致发酵前期(0～7 h)植物乳杆菌1-9发酵液中乙酸维持在较高水平;发酵12 h时,发酵液中乙酸含量逐渐上升,至发酵30 h时达到最高质量浓度(28.64 mg/mL)。发酵液中丙酸含量由发酵27 h时开始积累,至发酵48 h时达到最高质量浓度(0.33 mg/mL)。而发酵液中戊酸由发酵12 h时即开始积累,至发酵30 h时质量浓度达到最大(2.74 mg/mL)。可见,植物乳杆菌1-9代谢水苏糖产短链脂肪酸可能是导致发酵液pH值降低的重要原因。肠道中的植物乳杆菌通常由于产短链脂肪酸使肠道pH值降低,从而可以抑制致病性肠道细菌并调节免疫系统^[5]。

图4 植物乳杆菌1-9代谢水苏糖产生的短链脂肪酸变化

Fig.4 Changes of short chain fatty acids produced by Lactiplantibacillus plantarum 1-9 during stachyose metabolization

2.5 植物乳杆菌1-9发酵水苏糖的糖代谢历程分析

采用TLC法对植物乳杆菌1-9发酵水苏糖的糖代谢历程进行监测,见图5。泳道5中水苏糖样品显示为2个条带,表明水苏糖样品中除含水苏糖外,还含有一定杂质,经比对推断为α-乳糖。由TLC分析结果可知,随着发酵的进行,0～9 h时发酵液中蔗糖含量逐渐上升,推测是由于植物乳杆菌1-9表达的α-半乳糖苷酶首先作用于水苏糖的2个α-1,6-糖苷键,但由于空间位阻,优先选择作用于末端α-半乳糖苷键,生成半乳糖、少量乳糖和蔗糖,而生成的半乳糖可作为碳源被植物乳杆菌快速代谢。发酵12 h后,样品中的水苏糖被水解完毕,发酵液中存在残留的蔗糖及尚未被代谢完全的乳糖;植物乳杆菌1-9可能少量表达β-果糖苷酶和α-葡萄糖苷酶水解蔗糖生成葡萄糖与果糖后进一步作为碳源进行代谢;待蔗糖被消耗完毕后,植物乳杆菌1-9可能表达β-半乳糖苷酶对乳糖进行水解代谢;24 h至发酵结束,发酵液中无残存糖,此结果与植物乳杆菌1-9生长曲线吻合。

泳道1:半乳糖,泳道2:果糖,泳道3:α-乳糖,泳道4:蔗糖,泳道5:水苏糖,泳道6:mMRS;泳道7～17:0、3、5、7、9、12、24、27、30、36、48 h的发酵液上清液。

图5 植物乳杆菌1-9水苏糖代谢过程的薄层色谱分析

Fig.5 TLC analysis of stachyose metabolization processes by Lactiplantibacillus plantarum 1-9

2.6 植物乳杆菌1-9代谢水苏糖关键酶基因表达及酶活力分析

研究表明,乳酸杆菌中通常不存在低聚糖的特异性转运系统^[20],因此在代谢功能性低聚糖时,植物乳杆菌可通过糖苷水解酶初步降解低聚糖,再通过单糖或二糖的转运系统进入细胞质,进行糖酵解。例如植物乳杆菌在菊粉代谢过程中,通过fosE基因编码的β-果糖苷酶将菊粉进行初步水解后,通过蔗糖的磷酸转移酶转运系统(PTS)中的关键基因pts1BCA或果糖PTS转运系统进入细胞进行进一步代谢^[21-23]。根据低聚糖的结构不同,植物乳杆菌可分泌不同的糖苷水解酶,例如低聚半乳糖的水解关键酶β-半乳糖苷酶^[20]、短链低聚果糖的水解酶β-果糖呋喃糖苷酶 ^[24]。有研究证实,植物乳杆菌中聚集着参与半乳糖苷代谢的基因^[25-28],特别是对大豆低聚糖(例如棉子糖和水苏糖)的α-Gal结构具有独特的代谢及转运系统基因簇,其编码α-半乳糖苷酶的基因在转录水平上受部分具有α-Gal结构的糖调节^[27]。因此,通过构建植物乳杆菌1-9基因组框架及预测与注释关键代谢酶基因,结合水苏糖的α-Gal结构分析,从植物乳杆菌1-9基因组中预测到3个编码α-半乳糖苷酶的基因(5-359、33-1497、34-1513)可能为关键酶基因。采用qRT-PCR对预测的3个编码α-半乳糖苷酶的基因的相对表达量进行分析,结果见图6。由图6可知,植物乳杆菌1-9在代谢水苏糖时,基因5-359在发酵6 h时高表达,发酵12 h相对表达量降低;基因33-1497及34-1513相对表达量无显著变化,说明预测编码α-半乳糖苷酶的基因5-359可能为植物乳杆菌1-9代谢水苏糖过程中的关键酶。对植物乳杆菌1-9代谢水苏糖过程中培养基上清液α-半乳糖苷酶酶活力进行监测发现,发酵上清液中α-半乳糖苷酶活力在5～12 h时不断增高,发酵24 h至发酵结束时基本保持稳定。推测植物乳杆菌1-9以水苏糖为唯一碳源时,在生长延滞期与对数期前期主要表达α-半乳糖苷酶水解水苏糖生成半乳糖并被植物乳杆菌1-9代谢;而在对数生长期后期植物乳杆菌1-9可能继续编码β-果糖苷酶和α-葡萄糖苷酶等糖苷水解酶水解残留的乳糖和少量蔗糖。这与水苏糖诱导植物乳杆菌RB1增殖机制的研究结果相符^[16]。

图6 植物乳杆菌1-9编码α-半乳糖苷酶的基因表达情况

Fig.6 Expression of gene encoded α-galactosidase in Lactiplantibacillus plantarum 1-9

由实验结果可知,植物乳杆菌1-9可以通过表达α-半乳糖苷酶基因5-359,在以水苏糖为唯一碳源的情况下,分泌α-半乳糖苷酶,将水苏糖水解为半乳糖、葡萄糖等,进而促进植物乳杆菌1-9增殖。推测代谢过程见图7^[23]。

图7 植物乳杆菌1-9代谢水苏糖历程

Fig.7 Metabolic procedure of stachyose by Lactiplantibacillus plantarum 1-9

本研究从发酵羊乳中筛选分离得到1株乳酸菌菌株1-9,经分子生物学鉴定为植物乳杆菌。植物乳杆菌1-9对于水苏糖具有优异的代谢能力,发酵液在595 nm波长条件下吸光度与单糖(葡萄糖、半乳糖、果糖)无显著差异。植物乳杆菌代谢水苏糖可产生乙酸和戊酸,发酵30 h后乙酸及戊酸分别达到最高质量浓度,28.64 mg/mL和2.74 mg/mL;短链脂肪酸的积累导致了发酵液pH值显著降低。TLC分析植物乳杆菌代谢水苏糖历程表明,植物乳杆菌1-9优先表达α-半乳糖苷酶作用于水苏糖末端α-半乳糖苷键^[26-27],生成半乳糖、少量乳糖和蔗糖。通过对发酵液中α-半乳糖苷酶酶活力监测发现,植物乳杆菌1-9代谢水苏糖过程中可分泌α-半乳糖苷酶。qRT-PCR分析了植物乳杆菌1-9基因组中3个可能编码α-半乳糖苷酶的关键基因5-359、33-1497及34-1513的表达,结果表明,5-359可能表达α-半乳糖苷酶并参与植物乳杆菌代谢水苏糖。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波