北京工商大学宋焕禄教授等：热反应牛骨香精酶解工艺优化及关键气味化合物鉴定

畜禽骨是一种营养价值较高的肉类加工副产品。随着畜禽养殖业的扩大、屠宰量的增多,畜禽骨的产量随之增加,畜禽骨及其相关副产物的加工与增值利用成为了研究热点。牛骨素是牛骨的加工粗产物,是牛骨经过粉碎、加热浸提、过滤除渣、离心除油、浓缩后制得的牛骨髓抽提物。牛骨素中的优质蛋白含量高约34%,可溶性固形物含量约50%;根据制作过程中是否离心除油,牛骨素可分为浓汤型、清汤型等产品类别。近年来,天然香料香精的需求处于不断上升的趋势,以牛骨素作为蛋白酶解物来源,与糖类、氨基酸等原料,通过美拉德反应制备的热反应牛骨香精属于天然产品的范畴,既具有牛肉的独特香味,又有骨汤的鲜味,是深受消费者喜爱的复合调味料。

蛋白质水解是食品工业中开发肉类风味香精的重要过程。在食品生产过程中,游离氨基酸和多肽可以作为重要的风味前体物对食品质量产生影响:一方面其本身能够呈现一定滋味,而且还能与其他滋味成分交互作用增强或者减弱食品风味^[1];另一方面可作为风味原料或前驱物直接与糖类发生美拉德反应,增强香气^[2]。通过定向控制骨素酶解条件可产生多样化的目标产物,用于开发各种风味浓郁、醇厚自然的肉味香精^[3]。目前,研究多集中于鸡骨素和猪骨素等^[4-7],对于酶解牛骨素制备热反应牛骨香精的研究较少,因此,制备出风味醇厚、圆润自然的热反应牛骨香精具有较高的市场价值。

Chiang等^[8]研究了内切蛋白酶和外切蛋白酶酶解处理对牛骨提取物理化性质的影响,结果证明骨素的酶解在将低值肉制品转化为具有低黏度、无凝胶特性的高值功能成分方面展示了潜力。Zheng等^[9]研究了微波和超声波对牛骨蛋白酶水解产物的水解度、抗氧化活性和风味特性的影响,结果发现微波结合超声波可以提高牛肉骨粉中蛋白质的酶解效果,改善酶解产物的抗氧化性能和风味。Dong等^[10]从鸡骨素中高压提取蛋白质,发现鸡骨素在酶解8 h后,小分子肽含量与酶解1 h相比增加了74倍,结果证明鸡骨素及其酶解产物是一种新的、潜在的适合各种食品的营养补充剂。但已有研究均未对酶解骨素再经热反应制得的热反应香精进行深入研究。因此,本研究以牛骨素为原料,选用复合蛋白酶,利用单因素实验和响应面试验考察酶解温度、酶解时间、复合酶加酶量及复合酶加酶比例对酶解液水解度,以及由酶解液与糖、氨基酸等原料经美拉德反应制备的热反应牛骨香精的感官评分的影响,并利用高效液相色谱法测定游离氨基酸质量比、利用全二维气相色谱-嗅闻-质谱技术,分析牛骨素酶解前后制备的热反应牛骨香精关键气味化合物的质量比。本研究旨在为热反应牛骨香精工业化生产中的酶解工艺提供理论依据。

1.1 材料与试剂

牛骨素(清汤型,蛋白质质量分数为35%、氯化钠质量分数为13%、可溶性固形物质量分数为47%)、水解植物蛋白(hydrolyzed vegetable protein,HVP),湖南省嘉品嘉味生物科技有限公司;葡萄糖、木糖、半胱氨酸、半胱氨酸盐酸盐、硫胺素,河南兴源化工产品有限公司;复合风味蛋白酶Flavourzyme^TM 500MG(1.0×10⁵ U/g)、诺维信复合蛋白酶Protamex^TM(1.5×10⁵ U/g),丹麦诺维信公司;氨基酸混合标准试剂、邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯(9-fluorenylmethyl chloroformate, FMOC),美国Sigma公司;硼酸盐缓冲溶液、甲醇、乙腈、磷酸二氢钠、甲醛、氢氧化钠,国药集团化学试剂有限公司;2-甲基-3-庚酮,上海麦克林生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

8890A-5977型全二维气相色谱-嗅闻-质谱[配备的一维色谱柱为DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm),二维色谱柱为 DB-17ms(1.85 m×0.18 mm×0.18 μm)]、1200型高效液相色谱,美国安捷伦公司;Sniff 9100型嗅闻仪,瑞士Brechbuhler公司;BSA124S型电子天平,赛多利斯科学仪器有限公司;MP511型pH计,上海双旭电子有限公司; SA402B型电子舌,日本INSENT公司;HH-2型数显恒温水浴锅,北京天林恒泰科技有限公司;CR22N型高速冷冻离心机,天美(中国)科学仪器有限公司;KD-310型凯氏定氮仪,嘉盛(香港)科技有限公司;PEN3型便捷式电子鼻,德国Airsense公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酶解液的制备

酶解液的制备参考文献[11]方法并做出优化。将50 g牛骨素加入锥形瓶,于恒温水浴锅中加热,待温度恒定后加酶,开启电动搅拌棒进行搅拌,保持恒温酶解。酶解反应结束后将水浴温度迅速升至90 ℃,恒温保持10 min灭酶,制得牛骨素酶解液,冷却至室温备用。重复实验3次。

1.3.2 热反应牛骨香精的制备

根据实验室前期的方法并进行优化^[12]。称取牛骨素酶解液30.0 g,添加蒸馏水14.0 g、葡萄糖0.5 g、木糖1.0 g、半胱氨酸1.0 g、半胱氨酸盐酸盐0.5 g、硫胺素0.5 g和HVP 2.5 g于锥形瓶中,在pH值为7.0、120 ℃条件下反应1 h制备热反应牛骨香精,冷却至室温备用,重复实验3次。

1.3.3 水解度的测定

参照文献[13]的方法,对牛骨素酶解液的水解度进行测定,计算方法见式(1)。

(1)

式(1)中,氨基酸态氮的测定使用甲醛滴定法,g;总蛋白质量的测定使用凯氏定氮仪,g。

1.3.4 热反应牛骨香精的感官评价

由北京工商大学分子感官科学实验室成员(平均年龄为27岁)组成的感官评价小组,所有参加的评价员均符合ISO 6658、ISO 8586-1和ISO 8586-2要求。实验前对气味属性和基本五味进行4 h的感官训练,对热反应牛骨香精的整体风味轮廓进行评价。实验步骤:准确称取10 g样品于40 mL顶空瓶中,在55 ℃的恒温金属浴中加热。气味评价时需在相邻样品之间间隔5 min,必要时使用咖啡豆缓解嗅觉疲劳。滋味评价时将样品稀释10倍,并打乱序号,每两个样品之间使用纯净水漱口。滋味和气味的感官评价均按照10分制(6个梯度):未感知为0分,极弱为1～2分,气味或滋味较弱为3～4分,中等强度感知为5～6分,气味或滋味感知较强为7～8分,非常强烈为9～10分,感官评价使用的参比标准溶液见表1。

表1 感官评价使用的参比标准溶液

Tab.1 Reference standard solution for sensory evaluation

感官评分的计算见式(2)。

感官评分=0.6×(0.5×肉香分+0.3×烤香分+
0.2×焦糖香分+0.2×辛香分-0.1×酸味分-0.1×
焦煳味分)+0.4×(0.5×鲜味分+0.5×咸味分+
0.2×甜味分-0.1×苦味分-0.1×酸味分)。

(2)

1.3.5 牛骨素酶解工艺的优化

1.3.5.1 单因素实验设计

控制其他条件不变,依次考察酶解温度(45、50、55、60、65 ℃)、酶解时间(1、2、3、4、5、6 h)、复合酶加酶量(750、1 000、1 250、1 500、1 750 U/g) 、复合酶加酶比例[复合风味蛋白酶的加酶量(以酶活计)∶复合蛋白酶的加酶量(以酶活计)为1∶2、2∶2、3∶2、4∶2、5∶2]对牛骨素酶解液水解度和制备的热反应牛骨香精感官评分的影响。

1.3.5.2 响应面试验设计

在单因素实验基础上,以酶解温度、酶解时间、复合酶加酶量和复合酶加酶比例(复合风味蛋白酶的加酶量:复合蛋白酶的加酶量)4个因素作为自变量,以不同条件下制备的热反应牛骨香精感官评分为响应值,设计4因素3水平的响应面试验。采用Design-Expert 8.0软件Box-Behnken方法进行试验设计,确定较优的酶解条件。

1.3.6 游离氨基酸的测定

1.3.6.1 游离氨基酸的定性和定量

游离氨基酸的定性和定量方法参考文献[14]方法进行。利用高效液相色谱,采用安捷伦的柱前衍生法对牛骨素、酶解液、热反应牛骨香精中的16种游离氨基酸进行定量分析。分别取2 g牛骨素、酶解液、热反应牛骨香精加入6 g 0.1 mol/L的HCl,在4 ℃、10 000 r/min离心15 min,取上清液,过0.45 μm尼龙滤膜,待仪器检测,每个样品做3次平行,结果以“平均数±标准偏差”表示。

测定条件。色谱柱为Zorbax Eclipse-AAA (4.6 mm×150 mm×5 μm), 流动相A为40 mmol/L的NaH₂PO₄溶液,pH值为7.8; 流动相B为V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=45∶45∶10,流速为1 mL/min,进样量1 μL,检测波长设置为338 nm,柱温设置为45 ℃。梯度洗脱程序为0 min,0流动相B;1.9 min,0流动相B;18.1 min,37%流动相B;23.2 min,37%流动相B;24.0 min,100%流动相B;26.0 min,100%流动相B;27.0 min,0流动相B;30.0 min,0流动相B。

1.3.6.2 游离氨基酸滋味活性值的计算

参考文献[15]方法测定游离氨基酸。利用滋味活性值(taste activity value, TAV)判断呈味氨基酸对牛骨素、酶解液、热反应牛骨香精滋味的影响。TAV的计算见式(3)。

(3)

式(3)中,C_X表示味觉成分的质量比,mg/100g;R表示味觉成分的识别阈值,mg/100 g。

1.3.7 气味轮廓的测定

参考文献[16]方法使用电子鼻对牛骨素、酶解液测定气味轮廓。准确称取样品5 mL于40 mL顶空瓶中,55 ℃条件下加热30 min,然后依次用电子鼻对挥发性气味进行分析检测,电子鼻载气为干燥空气,设置测试时间为300 s,清洗时间为100 s,每组样品做3个平行。

1.3.8 滋味轮廓的测定

参考文献[17]方法使用电子舌对牛骨素、酶解液测定滋味轮廓。准确移取20 mL样品于烧杯中,按照1∶4加入蒸馏水,以10 000 r/min离心15 min后通过0.45 μm滤膜抽滤至澄清,分别取30 mL样品放于电子舌专用杯中进行检测,采样时间为120 s,每组样品检测4次。

1.3.9 关键气味化合物的鉴定

1.3.9.1 挥发性气味化合物的测定

参考Wang等^[18]的方法,利用全二维气相色谱-嗅闻-质谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry,GC×GC-O-MS)对牛骨素、酶解液分别制备的热反应牛骨香精的挥发性气味化合物进行测定。

准确称取5 g样品于20 mL干净无异味的顶空瓶中,加入1 μL质量浓度为0.816 μg/μL的内标化合物2-甲基-3-庚酮(溶于正己烷),盖好瓶盖。设置自动化进样程序,使样品在55 ℃的条件下平衡20 min,插入萃取头吸附40 min,在250 ℃条件下解析8 min。每个样品做3个平行。

气相条件。升温程序为初始温度40 ℃,保持3 min,以3 ℃/min的速率升至230 ℃,保持5 min,调制周期为3.5 s,进样口温度为250 ℃。高纯氦气作为载气,进样分流比为2∶1,分流流量为2 mL/min。

质谱条件。离子源温度为230 ℃,电子轰击源为70 eV,质谱扫描范围为全扫描,m/z范围为40～500 u,四极杆温度为150 ℃,检测器温度为250 ℃。

1.3.9.2 挥发性气味化合物的定性定量分析

挥发性气味化合物由质谱(mass spectrometry,MS)结果、化合物保留指数(retention index,RI)和气味(odor,O)描述共同确定,化合物的质谱结果通过Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.07.00和NIST 17数据库根据结构和匹配度检索鉴定,匹配度一般要求超过700,然后根据正构烷烃(C₇～C₃₀)获得保留指数对化合物二次鉴定^[19]。用内标化合物2-甲基-3-庚酮对热反应牛骨香精中的挥发性气味化合物进行半定量,计算方法见式(4)。

(4)

式(4)中,C_X为待测化合物的质量比,ng/g; C_O为内标的质量浓度,0.816 μg/μL; A_X为待测挥发性气味化合物的峰面积; A_O为内标化合物的峰面积; m为样品的质量,g; V为内标的体积,μL。

1.3.9.3 关键气味化合物的气味活性值计算

使用气味活性值(odor activity value,OAV)评估关键气味化合物对热反应牛骨香精整体香气的贡献。OAV值计算方法见式(5)。

(5)

式(5)中,C_i表示挥发性气味化合物的质量比,ng/g; OT_i表示该化合物在水中的阈值,ng/g。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2019和Origin 2021软件对数据进行整理,采用SPSS Statistics 19.0软件对酶解液的水解度和牛骨素制备的热反应牛骨香精的感官评分进行显著性分析,结果表示为“平均值±标准差”,采用Design-Expert V8.0.6软件分析响应面试验结果。

2.1 牛骨素酶解工艺的优化结果

2.1.1 单因素实验结果

不同酶解条件对酶解液水解度和制备热反应牛骨香精感官评分的影响见图1。

不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图1 不同酶解工艺对酶解液水解度和热反应牛骨香精感官评分的影响
Fig.1 Effects of different enzymatic hydrolysis processes on hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate and sensory score of thermal reaction bovine bone flavoring

酶解效果可以由水解度反映,水解度越高,释放的化合物越多^[20]。DH的标准测定较复杂,本研究用式(1)的计算值进行粗略估算。复合风味蛋白酶和复合蛋白酶的较适酶解温度均为50～55 ℃,45～65 ℃,随着酶解温度的升高,水解度和感官评分先上升后下降,50 ℃时水解度较高,肉香味厚重,当酶解温度高于较适温度后,酶活性降低或者部分活性丧失,水解度和感官评分呈下降趋势。酶解时间为4 h时制备的热反应牛骨香精感官评分较高,肉味浓厚,随着酶解时间的延长,感官评分逐渐降低,可能是由于酶解时间过长,分解出的氨基酸与其他成分发生反应产生了不良气味。4～6 h水解度无明显差异,推测是因为底物与酶活性位点基本完全结合,无多余的酶活位点参与反应,考虑到节能,选择4 h为较优酶解时间。复合酶加酶量为750～1 250 U/g时,酶解液水解度和热反应牛骨香精的感官评分显著增加(P<0.05)且与复合酶加酶量呈正相关,但加酶量继续增加时,水解度和感官评分逐渐减缓但差异不显著,这是因为底物一定时,随着加酶量的不断增加,没有过多的底物与酶结合,且过量的酶反而会抑制酶反应的进行,因此,较适复合酶加酶量为1 250 U/g。复合酶加酶量一定,随着复合风味蛋白酶与复合蛋白酶的加酶比例逐渐增加,当复合风味蛋白酶与复合蛋白酶加酶比例为3∶2时感官评分与水解度达到较大值,当复合酶加酶比例继续增加时,感官评分和水解度呈明显下降趋势,这与复合蛋白酶单独作用时水解度大于复合风味蛋白酶单独作用有关,因此随着复合风味蛋白酶比重的继续增加会降低酶解液水解度。

2.1.2 响应面试验结果

响应面试验设计与结果分析见表2和图2。

图2 不同的酶解因素交互作用对热反应牛骨香精感官评分的影响
Fig.2 Effect of interaction of different enzymatic hydrolysis factors on sensory score of thermal reaction bovine bone flavoring

表2 酶解工艺优化的响应面结果

Tab.2 Optimized response surface results for enzymatic hydrolysis process

对表2中的数据进行回归分析,得到二次多项回归方程为y=8.06+0.17A+0.38B-0.3C+0.013D-0.16AB-0.23AC+0.12AD-0.32BC+0.18BD+0.025CD-0.28A²-0.4B²-0.99C²-0.2D²。

因素间相互作用的强弱可以通过响应曲面反映,响应面呈凸形,表明因素之间的交互作用较强,作用显著。由图2可知,随着各因素值的增加,感官评分呈现不同程度的上升趋势,当各因素达到一定值继续增加时,响应值逐渐降低,说明热反应牛骨香精的感官评分与酶解温度、酶解时间、复合酶加酶量、复合酶加酶比例之间呈非线性关系。只有在特定的酶解条件下制备热反应牛骨香精,感官评分才会有较大值。通过模型得到的较优条件为酶解温度50 ℃、时间4 h、复合酶加酶量1 250 U/g、复合风味蛋白酶与复合蛋白酶的加酶比例为3∶2,感官评分为8.24分,进行3次重复实验后,感官评分为8.17分,与理论值无显著性差异,说明该工艺具有可行性。

2.2 牛骨素、酶解液及热反应牛骨香精中游离氨基酸的变化

牛骨素、酶解液及热反应牛骨香精中游离氨基酸的质量比变化见表3。

表3 牛骨素、酶解液、热反应牛骨香精中游离氨基酸的质量比、阈值、TAV值

Tab.3 Mass ratio, thresholds and TVA value of free amino acids in BBE, enzymatic hydrolysate and thermal reaction bovine bone flavoring

不同小写字母表示同行不同样品之间存在显著性差异(P<0.05)。

游离氨基酸具有鲜味、甜味、苦味、无味等呈味特征^[21], TAV用来表征化合物滋味活性的大小。

酶解液中除组氨酸和丙氨酸外,所有游离氨基酸的TAV相对于酶解前均显著提升。鲜味氨基酸在酶解液中质量比较高,丙氨酸虽然主要提供甜味,但是与鲜味氨基酸具有协同提鲜的作用^[22]。酶解液中苦味氨基酸约占游离氨基酸总质量比的一半,这与Kong等^[23]的研究结果相似,其指出苦味氨基酸是鸡肉酶解液中的主要氨基酸。另外,有研究表明,苦味氨基酸通常不具备味觉活性,苯丙氨酸和酪氨酸是苦味氨基酸也是芳香族氨基酸,当芳香族氨基酸阈值高于含量时,可以提高酶解液的鲜味和甜味^[24]。由于美拉德反应过程的消耗,大部分氨基酸质量比均显著性降低,推测这部分氨基酸转变为其他重要的呈味物质^[25],甜味氨基酸总量增加,可能与美拉德过程中涉及的Strecker降解、羰氨反应和肽降解等反应有关。热反应牛骨香精相较于酶解液所有苦味氨基酸质量比均减少且TAV值均小于1,这与李娇等^[26]的研究一致,他们发现美拉德反应可以改善酶解液的滋味并改变氨基酸的组成和比例。因此,经酶解大量的呈味氨基酸被释放出来,美拉德反应可以帮助减少酶解液中的苦味,增加鲜味和甜味,使热反应牛骨香精的滋味得到改善。

2.3 牛骨素酶解前后的气味轮廓分析结果

电子鼻分析牛骨素、酶解液的气味轮廓主成分分析(principal component analysis,PCA)和雷达图见图3。由图3(a)可知,PC1为86.8%,PC2为9.1%,贡献率之和接近95.9%,说明两个主成分能够反映样品之间的综合信息。PC1的方差贡献率远大于PC2,表明PC1轴向右距离越大,样品差异性越大。两个样品在横坐标上距离相对较近,但相互间无重叠部分,说明两个样品的挥发性物质有一定差异。由图3(b)可看出R3、R4、R5、R9变化几乎无影响,说明酶解后氨类、氢化物、有机硫化物、短链烷烃芳香等化合物的种类和含量变化不大。牛骨素和酶解液R2(对氮氧化物灵敏)、R8(对乙醇、部分芳香化合物灵敏)和R10(对长链烷烃类化合物灵敏)的响应值变化较为明显,推测这3个感应器是区分两个样品的重要指标。说明在酶解后,酶解液产生更多的氮氧化物,同时使牛骨素烷烃类中具有不愉快气味化合物的含量降低,在一定程度上可以改善牛骨素的整体风味。

图3 牛骨素和酶解液电子鼻响应值的PCA和雷达图
Fig.3 PCA and radar plot of electronic nose response values of BBE and enzymatic hydrolyate

2.4 牛骨素酶解前后的滋味轮廓分析结果

电子舌分析牛骨素、酶解液的滋味轮廓主成分分析(PCA)和雷达图见图4。由图4(a)可知PC1为77.1%,PC2为22.5%,贡献率之和为99.6%,说明酶解前后两个样品的滋味存在显著性差异。通过电子舌对牛骨素和酶解液中的4种基本味(酸、苦、咸、鲜)以及浓厚味、涩味进行滋味分析。由图4(b)可知,酶解后鲜味值较大,酶解使鲜味氨基酸大量释放,这与游离氨基酸的测定结果相符。浓厚味、咸味的响应值增加,可能是因为蛋白质水解后产生了具有咸味或类似咸味作用的肽^[27]。酸味响应值小于-30,说明样品中无该味道^[28]。苦味响应值降低但无明显变化,分析其原因,一方面可能是因为酶解过程中使用的复合风味蛋白酶包含内切蛋白酶和外切肽酶两种活性,可用来降低水解产物的苦味肽链,将其彻底降解为氨基酸;另一方面可能与苦味氨基酸不具备味觉活性,苦味易被其他味道掩盖有关。

图4 牛骨素和酶解液电子舌响应值的PCA和雷达图
Fig.4 PCA and radar plot of electronic tongue response values of BBE and enzymatic hydrolyate

2.5 热反应牛骨香精关键气味化合物的鉴定结果

牛骨素、酶解液分别制备热反应牛骨香精的特征风味二维谱图见图5。运用GC×GC-O-MS对牛骨素、酶解液分别制备的热反应牛骨香精进行色谱分析,结合嗅闻检测,共鉴定出挥发性化合物164种,包含27种醛类、30种酮类、12种醇类、16种酸类、7种含硫化合物、10种酯类、18种吡嗪类、10种呋喃类、6种噻唑类、4种噻吩类和24种其他类化合物,其中74种是气味活性化合物。牛骨素制备热反应牛骨香精样品鉴定出145种挥发性化合物,酶解液制备热反应牛骨香精鉴定出129种挥发性化合物。

图5 牛骨素和酶解液制备的热反应牛骨香精的全二维气相色谱-嗅闻-质谱
Fig.5 GC×GC-O-MS of thermal reaction bovine bone flavoring prepared by BBE and enzymatic hydrolysate

牛骨素和酶解液分别制备热反应牛骨香精中挥发性气味化合物的质量比和关键气味化合物的OAV见表4和表5。已鉴别出的物质中,酶解液制备的热反应牛骨香精产物中酸类物质总质量比显著增加,可能是由于氨基酸降解后经过氧化或还原作用产生,也可能是由饱和脂肪酸本身氧化降解产生^[29],牛骨素经酶解后发生美拉德反应生成了乙酸,乙酸具有强烈刺激性气味,属于低级饱和酸,虽然酸类化合物阈值较大,但酸类化合物与其他香气成分之间具有协同效应,可以使热反应牛骨香精整体气味更加丰富和强烈。醛类物质与其他类型化合物相比,总质量比较高,酶解液制备的热反应牛骨香精中产生了(E,E)-2,4-癸二烯醛,其阈值很低,OAV大于7,具有油味和鸡肉香味,对热反应牛骨香精的脂肪气息具有贡献作用。酮类化合物种类虽然较多,但其阈值相对较高,因此对热反应牛骨香精风味的贡献并不突出,然而有些酮类是形成杂环类化合物的重要中间体,对肉香味的形成有着必不可少的作用^[30],4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮呈现焦糖气息,具有明显的增香增甜效果。含硫化合物主要来自美拉德反应的产物或者氨基酸的热解,是决定肉味的关键物质,酶解液制备的热反应牛骨香精中产生了2-甲基-3-呋喃硫醇、糠基甲基硫醚和甲基糠基二硫醚这几种典型的肉香味化合物。含硫化合物阈值一般较低,因此这些化合物的产生对香精整体的肉香味特征形成具有重要的作用,这也是酶解液比牛骨素制备的热反应牛骨香精肉香味更浓郁突出的原因之一。呋喃类化合物通常在焦糖化和糖降解过程中产生,能增加热反应牛骨香精的焦糖味,对整体香气有较好的修饰作用。噻吩和噻唑类主要由硫胺素降解产生,是肉制品中主要的香气化合物。

表4 牛骨素和酶解液制备的热反应牛骨香精中的挥发性气味化合物

Tab.4 Volatile odor compounds in thermal reaction bovine bone flavoring prepared by BBE and enzymatic hydrolysate

续表4

续表4

续表4

续表4

a.MS、RI、O分别表示通过质谱、保留指数、嗅闻方法进行的鉴定;“—”表示未检测到。

表5 牛骨素和酶解液制备的热反应牛骨香精中关键气味化合物的OAV Tab.5 OAV of key odor compounds of thermal reaction bovine bone flavoring prepared by BBE and enzymatic hydrolysate

“—”表示未检测到或OAV小于1。

此外,由表5可知,牛骨素和酶解液所制备热反应牛骨香精产物中OAV>1的关键气味化合物共有22种,包括醛类6种、酮类2种、醇类1种、酯类2种、吡嗪类3种、呋喃类2种、烯类2种、含硫化合物4种。主要差异为牛骨素制备的热反应牛骨香精产物以果味、焦糖、烤香味为主,酶解液制备的热反应牛骨香精具有更多的脂肪、肉味气息,含硫化合物种类较多且贡献较高,主要贡献硫黄味、肉味和葱香味。其次是醛类化合物,主要贡献果香、花香、脂肪味。此外,酶解液制备的热反应牛骨香精产物中新产生了β-石竹烯,OAV>1,增强了香料、辛香味,使美拉德反应产物香气的丰富度与整体强度得以提升。

本研究通过单因素实验和响应面试验优化热反应牛骨香精的酶解工艺,较佳酶解条件为酶解温度50 ℃、时间4 h、复合酶加酶量1 250 U/g、复合风味蛋白酶与复合蛋白酶的加酶比例为1∶1。利用高效液相色谱分析牛骨素、酶解液和热反应牛骨香精中的游离氨基酸,发现酶解液中释放出大量的呈味氨基酸,酶解液中谷氨酸、缬氨酸、精氨酸和酪氨酸的TAV大于1,鲜味和甜味突出;热反应牛骨香精中的所有苦味氨基酸质量比减少,使热反应牛骨香精的滋味得到改善。通过电子鼻和电子舌分析牛骨素、酶解液的气味和滋味轮廓,发现酶解液中氮氧化物的气味特征增强,且酶解液中的鲜味、浓厚味、咸味响应值更高。利用GC×GC-O-MS测定牛骨素、酶解液所制备热反应牛骨香精中的挥发性气味化合物,共鉴定出164种挥发性化合物,牛骨素制备的热反应牛骨香精有145种挥发性气味化合物, OAV>1的关键气味化合物有17种,主要贡献烤香味、果味和甜香味;酶解液制备的热反应牛骨香精中共鉴定出129种挥发性化合物,有17种关键气味化合物,但脂肪味、肉香味和葱香味更明显,与牛骨素制备的热反应牛骨香精中的关键气味化合物相比,酶解液制备的热反应牛骨香精中新产生了(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-甲基-3-呋喃硫醇、甲基糠基二硫醚、己酸甲硫醇酯和β-石竹烯5种关键气味化合物。后续将进一步研究酶解液中的其他呈味物质,分离鉴定其滋味肽,探索风味的形成机制,为牛骨素在呈味调味料中的开发提供参考。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波