中国农业大学江正强教授等：基于模块优化强化大肠杆菌合成乳糖-N-新四糖的研究

乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose, LNnT)是一种直链人乳寡糖(human milk oligosaccharides, HMOs),由半乳糖、葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖三种单糖组成,分子结构为Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。正常母乳中HMOs含量为5～20 g/L,其中LNnT含量占6%^[1-2]。LNnT能够影响大脑皮层发育及海马体基因的表达,进而影响智力发育^[3]。LNnT可作为益生元促进肠道中双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等有益菌的增殖^[4]。LNnT还能够与肿瘤坏死因子受体互作减弱肠上皮细胞炎症,在婴幼儿肠道发育与肠道稳态中发挥重要作用^[5]。近年来,美国、欧盟、澳大利亚、新西兰等国家和地区已批准了LNnT作为新食品原料添加到婴幼儿配方奶粉中^[6]。2023年10月,我国正式批准了LNnT为新营养强化剂,用于婴儿配方食品和儿童用乳粉。LNnT的合成方法主要有化学法、酶法以及微生物发酵法。化学法需要严格的控制条件,步骤冗长且繁琐;制备过程中需使用有毒试剂以消除保护基团,限制了LNnT在食品领域中的应用^[7]。酶法常采用高活性半乳糖苷酶^[8]或半乳糖基转移酶^[9]。以半乳糖基转移酶为工具酶时,需要价格高昂的乳糖-N-三糖(lacto-N-triose Ⅱ,LNTⅡ)为底物。微生物发酵法具有操作方便、环境友好、反应条件温和等优点,近年来成为LNnT合成的主流方法。

大肠杆菌生长周期短、遗传背景明确,是目前合成LNnT使用最广泛的底盘细胞^[10]。大肠杆菌合成LNnT的路径:以葡萄糖或甘油为碳源先合成尿苷二磷酸(UDP)-N-乙酰氨基葡萄糖和尿苷二磷酸(UDP)-半乳糖,随后利用外源β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶和β-1,4-半乳糖基转移酶将N-乙酰氨基葡萄糖基和半乳糖基转移到乳糖上合成LNnT^[11]。Priem等^[12]将脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)来源的β-1,4-半乳糖基转移酶lgtB引入E. coli JM109中,首次实现LNnT的胞内合成。为提高E. coli K12 MG1655对乳糖的利用率,Zhang等^[13]过表达了乳糖渗透酶基因,同时敲除了β-半乳糖苷酶基因和乳糖操纵子,最终LNnT摇瓶产量提高了9.3倍。迄今,已从睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)、伴放线放线杆菌NUM4039(Aggregatibacter actinomycetemcomitans NUM4039)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)中发掘了β-1,4-半乳糖基转移酶基因用于大肠杆菌合成LNnT^[14-16]。但引入外源β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶和β-1,4-半乳糖基转移酶会导致底盘细胞代谢流失衡^[17],而模块优化能够调整合成路径各模块适配性,重置底盘细胞代谢流,有效提高目标产物的产量^[18]。Zhang等^[19]利用不同拷贝数质粒将LNnT合成路径划分为LNTⅡ合成模块(lgtA-glmM-glmU-S^*)、LNnT下游合成模块(lgtB-pgm-galE-galU)以及底物-辅因子供应模块(lacY-prs)三个模块,其中外源酶β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶lgtA和lgtB被划分到不同模块中,模块优化后,LNnT产量在3 L发酵罐中达19.4 g/L,但与摇瓶产量相比仅提高了3.2倍,菌株放大生产性能不佳。Hu等^[20]将外源酶lgtA和lgtB划分到同一模块中,通过模块优化提高了大肠杆菌合成LNnT产量,在3 L发酵罐中LNnT产量达13.2 g/L,但在发酵终点时,中间物质LNTⅡ累积量达到5 g/L 左右,不利于产物的后期纯化。因此使用模块优化策略提高大肠杆菌合成LNnT产量时,模块划分情况以及模块表达强度均会影响产物合成^[19-20]。目前,尚未见将lgtA和A. actinomycetemcomitans来源的β-1,4-半乳糖基转移酶组装到同一模块中,并进行模块组合优化合成LNnT的相关报道。

为探究模块优化对大肠杆菌合成LNnT产量的影响,基于LNnT合成关键前体物质,本研究拟将外源酶所在路径划分为模块A,UDP-半乳糖合成路径和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成路径划分为模块B和模块C。在大肠杆菌BL21 (DE3)ΔlacZ中利用不同拷贝数质粒优化LNnT合成模块A、B和C的表达强度。为进一步强化各模块的表达强度,利用CRISPR/Cas9技术敲除模块A中糖转运体基因setA,敲除模块B中UDP-葡萄糖-6-脱氢酶基因ugd和甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA,敲除模块C中UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶基因wecB和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因nagB。在获得合成LNnT高产菌株的基础上,拟通过发酵条件优化以提高LNnT产量。进一步在5 L发酵罐中进行放大发酵,希望为LNnT工业化制备和LNnT的生物合成提供参考。

1.1 实验菌株与试剂

1.1.1 实验菌株

用于重组质粒构建的E. coli DH5α感受态细胞,北京博迈德基因技术有限公司。

以E. coli BL21 (DE3) ΔlacZ(E01,本实验室储藏)为出发菌株,用于LNnT合成。

1.1.2 实验试剂

质粒中量提取试剂盒和细菌基因组提取试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司;抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和壮观霉素,Merck-Sigma中国公司;硫胺素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、限制性内切酶DpnI、胰蛋白胨、酵母提取物,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;LNnT(95%)标准品,上海源叶生物科技有限公司。

LB培养基和甘油优化培养基参照文献[15]的方法配制。

1.2 仪器与设备

ZQLY-180E型全温振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司;T100型PCR仪和MicroPulser型电穿孔仪,美国Bio-Rad公司;BG-subMIDI型多用途水平电泳仪,北京天诚沃德生物技术有限公司;3-30KS型台式高速低温制冷离心机,德国Sigma公司;BIOTECH-5JG型5 L离位灭菌玻璃发酵系统,上海保兴生物设备工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模块优化菌株的构建及发酵合成LNnT产量的检测

为探究不同组合模块对LNnT合成产量的影响,将LNnT合成模块划分为A、B、C三个模块,其中外源酶所在路径为模块A,过表达模块A中的lgtA 和A. actinomycetemcomitans NUM4039来源的β-1,4-半乳糖基转移酶基因;UDP-半乳糖合成路径为模块B,过表达模块B中galE、galT和galK基因;UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成路径为模块C,过表达模块C中glmM、glmU和glmS基因(图1)。

galE:UDP-葡萄糖-4-差向异构酶;galT:半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶;galK:半乳糖激酶;Aa-β-1,4-galT:A. actinomycetemcomitans NUM4039 来源的β-1,4-半乳糖基转移酶;lacZ:β-半乳糖苷酶;glmM:L-谷氨酰胺-D-果糖-6-磷酸转氨酶; glmU:N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿酸基转移酶/氨基葡糖-1-磷酸乙酰基转移酶;glmS:葡糖胺-6-磷酸合酶;nagB:氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶;wecB:UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶;ugd:UDP-葡萄糖-6-脱氢酶;manA:甘露糖-6-磷酸异构酶;setA:糖转运体;lacY:乳糖渗透酶。

图1 大肠杆菌LNnT合成路线及模块划分

Fig.1 Synthetic pathway and module division of LNnT in E. coli

1.3.1.1 模块优化用重组质粒的构建方法

为探究模块A、B和C的组合方式和表达强度对大肠杆菌合成LNnT产量的影响,将低拷贝质粒(pCDFDuet-1)、中拷贝质粒(pETDuet-1)和高拷贝质粒(pRSFDuet-1)用于合成路径酶的表达及模块优化。参照文献[15]构建模块优化用质粒,以构建重组质粒pCDF-lgtA-A.act为例,分别用引物对lgtA-F/R(5′-ATGCCGAGCGAAGCCTTT-3′/5′-CATTATGCGGCCGCAAGCTTTTAACGATTTTTCAGCAGA CGATGC-3′)和pCD-lgtA-F/R(5′-AAGCTTGCGGCCGCATAATG-3′/5′-AAAGGCTTCGCTCGGCATG TCGACCTGCAGGCGCG-3′)扩增lgtA基因片段和线性化载体,再利用无缝克隆试剂盒(北京康润诚业生物科技有限公司)构建pCDF-lgtA重组质粒。以测序正确的pCDF-lgtA为模板,用引物对pCD-LA-F/R(5′-TAAACATTAAGCGATCGCTGACGTCGGTACCCT CGAGTCT-3′/5′-TGCTGTTCATTGTATATCTCCTTCT TATACTTAACTAATATACTAAGATGGGG-3′)扩增出线性载体,以合成基因为模板,用引物对A.act-F/R(5′-GAGATATACAATGAACAGCACCGAAAATAAAA ACTTTGTTATCAGC-3′/5′-CAGCGATCGCTTAATGT TTACGTTTTTCATATTTCAGGTTAATTTTG-3′)扩增出Aa-β-1,4-galT基因片段。将片段与线性载体连接后转入E. coli DH5α感受态细胞中,挑取转化子并测序验证阳性转化子。类似地,构建重组质粒pCDF-A.act-lgtA、pET-lgtA-A.act、pRSF-lgtA-A.act、pET-galE、pRSF-galE、pET-galE-galT、pET-galE-galT-galK、pCDF-glmM、pCDF-glmM-glmU、pCDF-glmM-glmU-glmS。

1.3.1.2 模块优化菌株的构建方法

为探究模块优化对大肠杆菌合成LNnT产量的影响,以E01为出发菌株,构建重组菌株:E02含pCDF-lgtA-A.act,E03含pCDF-A.act-lgtA,E04含pCDF-lgtA-A.act和pET-galE,E05含pCDF-lgtA-A.act和pET-galE-galT,E06含pCDF-lgtA-A.act和pET-galE-galT-galK,E07含pCDF-lgtA-A.act和pRSF-galE,E08含pET-lgtA-A.act和pCDF-galE,E09含pET-lgtA-A.act和pRSF-galE,E10含pRSF-lgtA-A.act和pET-galE,E11含pRSF-lgtA-A.act和pCDF-galE,E12含pRSF-lgtA-A.act、pET-galE和pCDF-glmM,E13含pRSF-lgtA-A.act、pET-galE和pCDF-glmM-glmU,E14含pRSF-lgtA-A.act、pET-galE和pCDF-glmM-glmU-glmS。其中,lgtA和A.act分别来源于N. meningitidis和A. actinomycetemcomitans NUM4039,经过密码子优化后用于LNnT合成。以重组菌株E02构建为例:将菌株E01制成电转感受态细胞,利用电转仪(1.8 kV、0.5～0.6 ms)将质粒pCDF-lgtA-A.act导入,孵育1 h后涂布于抗性平板,挑取4～5个单菌落并电泳验证。类似地,构建重组菌株E03至E14。

1.3.1.3 模块优化菌株发酵合成LNnT产量的检测方法

待菌株OD₆₀₀达0.6～0.8,加入IPTG和乳糖并摇瓶发酵72 h。发酵结束后煮沸发酵液,12 000 r/min离心10 min,收集上清液后过滤膜,采用HPLC检测LNnT产量。HPLC系统(Waters e2695型)配备示差检测器,色谱柱为 ROA-Organic Acid H+ (8%)液相色谱柱(300 mm×7.8 mm×8 μm);流动相为0.5 mmol/L H₂SO₄,流速为0.6 mL/min,柱温为60 ℃,样品进样量为10 μL。

1.3.2 模块强化菌株的构建

糖转运体A(setA)转运底物广泛,对LNTⅡ具有一定转运能力^[21],UDP-葡萄糖-6-脱氢酶和甘露糖-6-磷酸异构酶能够降解模块B中的UDP-半乳糖和果糖-6-磷酸,UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向异构酶和氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶能够降解模块C中氨基葡萄糖-6-磷酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖。为减少各模块中关键物质的流失,在起始菌株E01的基础上通过CRISPR/Cas9技术^[22]敲除模块A中setA基因,模块B中ugd和manA基因以及模块C中wecB和nagB基因。构建底盘细胞E. coli BL21(DE3) ΔlacZΔugd(ZU)、E. coli BL21(DE3) ΔlacZΔugdΔwecB(ZUW)、E. coli BL21(DE3) ΔlacZΔugdΔwecBΔnagB(ZUWN)、E. coli BL21(DE3) ΔlacZΔugdΔwecBΔnagBΔmanA(ZUWNM)、E. coli BL21(DE3) ΔlacZΔugdΔsetA(ZUA)、E. coli BL21(DE3) ΔlacZΔugdΔwecBΔsetA(ZUWA)。

重组质粒pRSF-lgtA-A.act和pET-galE电转导入ZU、ZUW、ZUWN、ZUWNM、ZUA和ZUWA感受态细胞后构建重组菌株E15至E20。SetA为LNTⅡ转运体,过表达模块C能够提高LNTⅡ产量,便于观察setA敲除后LNnT产量变化。因此将重组质粒pCDF-glmM、pCDF-glmM-glmU和pCDF-glmM-glmU-glmS电转导入重组菌株E15分别构建重组菌株E21至E23。将重组质粒pCDF-glmM、pCDF-glmM-glmU和pCDF-glmM-glmU-glmS电转导入E20分别构建重组菌株E24至E26。摇瓶发酵72 h后采用HPLC测定LNnT和LNTⅡ产量。

1.3.3 LNnT合成的发酵条件优化

为探究培养温度、甘油添加量、细胞密度对LNnT合成产量的影响,以OD₆₀₀与LNnT产量为指标,依次以培养温度、甘油添加量及细胞密度为影响因素进行单因素实验。确定最适单因素后,组合优化各摇瓶发酵条件,并确定最适发酵条件。

为评估重组菌株E20的放大生产性能,将150 mL培养液转接到含1.35 L甘油优化培养基的5 L发酵罐中,甘油初始质量浓度为15 g/L。菌体OD₆₀₀达到17时,温度降低至25 ℃,加入乳糖和IPTG诱导发酵。调节转速使溶氧维持在30%,空气通气量为1 m³/h,及时补料使甘油和乳糖质量浓度不低于5 g/L。

2.1 模块优化对合成LNnT产量的影响

模块优化对大肠杆菌生长及其合成LNnT产量的影响,实验结果见图2。由图2(a)可知,模块A初步实现了LNnT合成,其中重组菌株E02合成LNnT产量高于E03。由图2(b)可知,引入模块B并优化模块A和B表达强度构建的重组菌株(E04至E11)中重组菌株E10合成LNnT产量最高(0.87 g/L),且OD₆₀₀大于重组菌株E07至E09。由图2(c)可知,在重组菌株E10中引入模块C构建重组菌株E12至E14。当模块C中过表达基因数量增加时,重组菌株E12至E14产量反而下降。结果表明,重组菌株E10合成LNnT产量最高,模块C过表达不利于LNnT合成。

图2 模块优化对合成LNnT产量及细胞生长的影响

Fig.2 Influence of module optimization on LNnT synthesis and cell growth

基因在质粒载体中的排列会影响基因的表达以及表达后的蛋白空间折叠^[23]。比较重组菌株E02和E03合成LNnT产量,发现Aa-β-1,4-galT位于lgtA后表达有利于LNnT的合成[图2(a)]。galE、galT、galK是大肠杆菌合成UDP-半乳糖关键酶^[20]。本研究尝试提高galE、galT和galK表达水平以增加LNnT产量,但过表达galT和galK不利于产物合成[E05和E06,图2(b)]。Hu等^[20]过表达galE、galT和galK三种酶基因提高了LNT产量,其可能原因是β-1,4-半乳糖基转移酶Aa-β-1,4-galT利用 UDP-半乳糖能力低于β-1,3-半乳糖基转移酶 wbgO。 重组菌株E12至E14过表达模块C后菌体OD₆₀₀均有所提升,但LNnT产量逐渐降低,因此仅需过表达模块B中的galE即可提高LNnT产量[图2(c)]。

2.2 基因敲除强化模块表达对合成LNnT产量的影响

敲除竞争路径基因能够减少中间物质流失,提高目标产物合成代谢流^[11]。敲除各模块中竞争路径酶基因对大肠杆菌生长及其合成LNnT产量的影响见图3。由图3(a)可知,组合敲除了模块A中的setA、模块B中的ugd和manA、模块C中的nagB和wecB以提高模块表达强度。敲除ugd后,重组菌株E15合成LNnT产量为1.08 g/L。重组菌株E17合成LNnT产量接近重组菌株E15,敲除manA后LNnT产量降低。与重组菌株E17相比,重组菌株E19合成LNnT产量降低了9.98%,E20合成LNnT产量最高,为1.16 g/L。由图3(b)可知,敲除setA后,重组菌株E19和E20的胞外LNTⅡ含量和全细胞LNTⅡ含量均减少50%以上。由图3(c)可知,引入模块C的重组菌株合成LNnT产量有所降低,但敲除setA的重组菌株(E21至E23)合成LNnT产量明显高于未敲除setA的菌株(E24至E26)。由图3(d)的HPLC检测结果发现,发酵过程有副产物产生,重组菌株E20副产物的峰面积明显高于重组菌株E15。

图3 敲除不同基因对合成LNnT产量及细胞生长的影响

Fig.3 Effects of different genes knock-out on LNnT synthesis and cell growth

UDP-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ugd)能够转化UDP-半乳糖为UDP-葡糖醛酸,敲除ugd能够阻断UDP-半乳糖的降解,LNnT产量由0.87 g/L提高到1.16 g/L[图3(a)]。Zhu等^[24]的研究表明,敲除wecB和nagB能够提高LNTⅡ的产量,而本研究敲除了重组菌株E15中模块C的wecB和nagB后,LNTⅡ及LNnT产量未发生明显变化,同时限制了细胞生长,OD₆₀₀由13.1降低到11.5 [图3(a)和(b)],因此模块C的强化不利于LNnT合成。此外,敲除了manA强化模块B,但LNnT产量呈下降趋势[图3(a)],因此敲除manA也不利于LNnT合成。敲除重组菌株E15中setA后,LNnT产量增加[图3(a)和(c)],同时提高了LNTⅡ的利用率,减少了LNTⅡ胞内积累,便于后期纯化[图3(b)]。Liao等^[16]为提高UDP-半乳糖含量,敲除了大肠杆菌中ugd、wcaC、wcaJ、otsA、ushA和agp基因,LNnT产量较敲除前提高了46%,但LNTⅡ产量也随之提高,不利于LNnT的纯化。HPLC分析结果表明,LNnT合成过程伴随副产物的产生,该副产物出峰时间早于LNnT,推测该副产物是在LNnT的基础上额外产生的,对比分析重组菌株E15和E20副产物峰面积,发现E20峰面积明显高于重组菌株E15[图3(d)],因此副产物的产生是重组菌株E15和E20发酵合成LNnT差异不显著的主要原因。

2.3 发酵条件优化对合成LNnT产量的影响

经模块优化构建的重组菌株E20合成LNnT产量最高,在此基础上探究发酵条件对重组菌株E20合成LNnT产量的影响。发酵温度、甘油添加量及初始诱导OD₆₀₀对菌株生长及合成LNnT产量的影响见图4。由图4(a)可知,25 ℃发酵,LNnT产量最高,22 ℃和28 ℃时LNnT产量降低,28 ℃时菌体OD₆₀₀最高,为15.8。由图4(b)可知,甘油添加量为15 g/L时,LNnT产量比添加20 g/L甘油的产量高,甘油添加量为25 g/L时菌株OD₆₀₀最高,为13.6。由图4(c)可知,当初始诱导OD₆₀₀ 达到1.2时,LNnT产量最高,为1.18 g/L,当初始诱导OD₆₀₀ 达到1.4时,LNnT产量呈下降趋势。由图4(d)可知,经多因素组合优化,甘油添加量为15 g/L、OD₆₀₀达1.2时诱导,LNnT产量最高,为1.28 g/L,比优化前提高了10.34%。

图4 不同发酵条件对合成LNnT产量和重组菌株E20生长的影响

Fig.4 Effects of different fermentation conditions on LNnT synthesis and growth of recombinant strain E20

培养温度、诱导条件、底物浓度等发酵条件在微生物发酵合成中具有重要作用。经单因素条件优化,发现最适培养温度[图4(a)]与含有A. actinomycetemcomitans NUM4039来源β-1,4-半乳糖基转移酶的重组菌株培养温度一致^[15],表明25 ℃培养更有利于外源酶Aa-β-1,4-galT的表达。与甘油添加量为10 g/L的菌株相比,甘油添加量为15 g/L时菌株合成LNnT产量更高[图4(b)],表明底物添加量少不能满足产物的大量合成,同时不利于菌株的生长。Zhang等^[15]在大肠杆菌细胞密度达0.6时开始诱导发酵,且未优化诱导时细胞密度。本研究在OD₆₀₀达1.2时诱导,LNnT产量最高[图4(c)]。因此,培养温度为25 ℃、甘油添加量为15 g/L以及OD₆₀₀达1.2时诱导是重组菌株E20高效合成LNnT的最适发酵条件[图4(d)]。

2.4 分批补料发酵合成LNnT分析

为评估重组菌株E20的放大生产性能,重组菌株E20在5 L发酵罐中进行分批补料发酵情况见图5。由图5(a)可知:诱导发酵10～15 h,菌体OD₆₀₀从22.3迅速增长到85;72 h后,菌体量呈下降趋势;LNnT产量在发酵69 h时达到最高,为15.53 g/L。由图5(b)可知,LNnT生产强度则在发酵29 h时达到最高[0.43 g/(L·h)],随后逐渐降低。

图5 分批补料发酵合成LNnT

Fig.5 Synthesis of LNnT via fed-batch fermentation

分批补料发酵能更好地比较重组菌株E20与已报道菌株合成LNnT的差异。重组菌株E20在5 L发酵罐中合成LNnT情况、细胞生长情况以及底物消耗情况见图5。经分批补料发酵,重组菌株E20合成LNnT产量仅低于目前已报道的最高水平(22.07 g/L)^[16]。诱导前重组菌株E20快速消耗甘油用于菌体生长,细胞生长量达到峰值后处于稳定状态[图5(a)],说明菌体在发酵过程中生长状况较好。Zhang等^[15]使用Aa-β-1,4-galT构建了重组菌株,分批补料发酵47.5 h后,LNnT产量达12.1 g/L。而重组菌株E20在更短的发酵时间(28.5 h)内LNnT产量达12.15 g/L[图5(a)],可能原因是本研究优化了LNnT合成模块,提高了LNnT合成效率。Hu等^[20]同样采用模块优化策略优化大肠杆菌合成LNnT,但分批补料发酵产量为13.25 g/L,表明将Aa-β-1,4-galT与lgtA构建到同一模块中更有利于LNnT合成。此外,LNnT生产强度在发酵29 h时达0.43 g/(L·h)[图5(b)],与目前报道最高产重组菌株L1315(含pRSF-AE和pET-HpgalT质粒,敲除lacZ、ugd、ushA和wcaC基因,基因组整合galETKM)发酵54 h时相近,但重组菌株E20的LNnT发酵终点产量低于重组菌株L1315[图5(a)],原因可能是:1)所使用的外源酶β-1,4-半乳糖基转移酶不同;2)敲除基因策略不同;3)发酵条件不同。因此重组菌株的构建及发酵条件在大肠杆菌合成LNnT中占据重要地位。

为提高大肠杆菌合成LNnT产量,本研究对LNnT合成模块进行了优化,利用pRSFDuet-1质粒和pETDuet-1质粒分别实现了UDP-半乳糖合成模块A和LNnT合成模块B在大肠杆菌中的表达平衡,此时重组菌株合成LNnT产量最高达0.87 g/L。为强化模块A、B和C的表达强度,敲除模块A中糖转运基因setA、模块B中β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖-6-脱氢酶基因ugd,成功构建了高产LNnT重组菌株E20,LNnT产量达1.16 g/L。为进一步提高LNnT产量,对重组菌株E20的摇瓶发酵条件进行了优化,培养温度为25 ℃,甘油添加量为15 g/L,OD₆₀₀达1.2时,LNnT摇瓶产量最高,达1.28 g/L。在5 L发酵罐中,分批补料发酵,LNnT产量为15.53 g/L,最高生产强度为0.43 g/(L·h),达目前制备较高水平。本研究表明,将外源β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶和A. actinomycetemcomitans NUM4039来源的β-1,4-半乳糖基转移酶组装到同一模块中能够提高大肠杆菌合成LNnT产量。本研究旨在为采用模块优化策略改造其他底盘细胞提高人乳寡糖产量的相关研究提供参考。由于LNnT的合成伴随着副产物的产生,后续实验将明确副产物结构并通过基因敲除等手段减少副产物的产生。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波