西北农林科技大学刘夫国教授等：共递送姜黄素和EGCG脂质体的构建及其对神经炎症的作用

姜黄素(curcumin,CUR)是从姜黄根茎中提取的具有生物学活性的物质,是一种疏水性多酚。姜黄素含有多种官能团,包括β-二酮基、碳-碳双键和含有不同数量羟基和甲氧基取代基的苯基环^[1]。研究表明,姜黄素具有广泛的生物活性,如抗氧化和抗炎等。姜黄素的天然抗炎活性与类固醇药物和非类固醇药物(吲哚美辛和苯丁胺酮等)不相上下,但后者具有危险的副作用。姜黄素发挥抗炎作用的途径,可能是通过抑制COX-2、iNOS和细胞因子(干扰素IFN和肿瘤坏死因子TNF等)以及激活转录因子(NF-κB和AP-1等)的产生来实现的。绿茶多酚是一种具有神经保护作用的多酚,其中表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin gallate,EGCG]为主要组成成分。EGCG已显示出增加细胞活力、减少活性氧^[2]和内质网应激标志物以及凋亡标志物的表达水平的作用^[3-4]。EGCG也可以改善脑部炎症和神经元损伤,进而延缓症状的发生^[5-7]。研究表明,姜黄素和EGCG在疾病预防和健康促进方面具有协同作用。Rahman等^[8]研究表明,与单用EGCG或姜黄素相比,联合使用EGCG和姜黄素能显著改善小鼠海马组织中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、高级氧化蛋白产物、一氧化氮和脂质过氧化物的水平。Ruzicka等^[9]研究表明,姜黄素和EGCG联合使用可增加轴突萌发,减少神经胶质疤痕的形成,并改变巨噬细胞炎症蛋白1-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-4和白细胞介素-6细胞因子的水平。目前,对于姜黄素和EGCG的研究只是简单地将二者混合使用,没有解决姜黄素和EGCG的代谢动力学差异的局限性和二者的生物活性问题。

脂质体是具有类脂质双分子层结构的微囊,可以包封亲水性和疏水性的食品功能因子,且包封后的功能因子能够更有效地到达靶向部位^[10-14];同时,对于不同的递送环境,可根据环境的特异性,对脂质体进行特定修饰,以达到高效和靶向递送的目的^[15-17]。小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻巨噬细胞,是先天免疫反应的关键参与者。异常激活的小胶质细胞通过分泌多种促炎细胞因子和介质,包括TNF-α、白细胞介素-1β (IL-1β)、白细胞介素-6 (IL-6)等^[17],显著增加神经炎症和神经毒性^[18]。因此,小胶质细胞常被用作神经炎症的细胞实验模型。

为了提高姜黄素和EGCG的稳定性,更好地发挥其生物活性,克服二者在代谢动力学方面的局限性,本研究拟采用BV2小胶质细胞建立脂多糖(LPS)诱导的神经炎症模型,构建同时包封姜黄素和EGCG 的脂质体系统,探究姜黄素和EGCG共递送体系对神经炎症的干预作用。本研究旨在为姜黄素和EGCG的生物利用度的提高,以及相关功能食品的研发提供一定的技术支撑。

1.1 材料与试剂

蛋黄磷脂(EYPC)和胆固醇,上海艾伟拓医药科技有限公司;乳铁蛋白(纯度>96%),新西兰Westland公司;透明质酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(纯度为95%)和噻唑蓝(MTT),Sigma-Aldrich公司;姜黄素标品(纯度为95%)和EGCG标准品(纯度为99%),北京纵横科技公司;RPMI-1640培养基,美国HyClone公司;胎牛血清,美国Gemini生物科技有限公司;胰酶消化液,美国赛维尔生物科技有限公司;活性氧检测试剂盒、JC-1线粒体膜电势检测试剂盒、LPS,上海索莱宝生物公司;吐温80(Tween 80)、二甲基亚砜(DMSO),美国MP公司。

1.2 仪器与设备

DZKW-4型电子恒温水浴锅,北京市中兴伟业仪器有限公司;RE-501型旋转蒸发仪,上海况胜实业发展有限公司;HC-3018R型高速冷冻离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司;Nano-ZEN 3600型激光纳米粒度仪,英国Malvern仪器有限公司;LGJ-25C型真空冷冻干燥器,北京四环仪器厂;JEM-1400 PLUS型透射电子显微镜,日本电子公司;Model 680型多功能酶标仪,美国Bio-Rad公司;IX71型倒置荧光显微镜,日本Olympus公司;LC-CB-650E型超声细胞破碎仪,上海沪析实业有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 负载姜黄素和EGCG的脂质体的制备

采用薄膜超声法制备负载姜黄素和EGCG的脂质体。将不同质量比例的蛋黄磷脂(EYPC)、胆固醇、吐温80(Tween 80)和姜黄素溶解在氯仿和乙醇(体积比2∶1)的混合溶剂中。磷脂与胆固醇的质量比设置为2∶1、6∶1、10∶1、14∶1和18∶1,磷脂与Tween 80的质量比为10∶1、10∶2和10∶3,充分溶解后转移到圆底烧瓶中。利用旋转蒸发仪将溶剂蒸发干,将样品放到真空干燥箱中过夜,将有机试剂彻底蒸发。向制备所得样品中加入EGCG水溶液,旋蒸水合样品,水合时间选择30、40、50 min,将其置于超声细胞破碎仪中使体系分散,超声时间选择5、10、15、20 min,得到均匀分散的脂质体。用0.22 μm的滤膜过滤,除去未包封的姜黄素和EGCG,整个过程避光处理,得到的样品用氮气封装。同时设置空白脂质体对照样品(与负载姜黄素和EGCG脂质体的制备方法相同,但不添加姜黄素和EGCG)。

1.3.2 负载姜黄素和EGCG的复合脂质体的制备

准确称取适量的乳铁蛋白溶于蒸馏水,配制成质量浓度为15 mg/mL的乳铁蛋白溶液。将溶液置于超声细胞破碎仪中,超声2 h使乳铁蛋白充分溶解。分别取体积为0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL的乳铁蛋白溶液逐滴添加到脂质体溶液中,然后将整个体系置于磁力搅拌器(600 r/min)中搅拌1.5 h,使脂质体溶液充分反应。

准确称取适量的透明质酸溶于蒸馏水,配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液。待透明质酸溶液完全溶解后,分别取体积为0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 的透明质酸逐滴添加到乳铁蛋白修饰后的脂质体溶液中,将其置于磁力搅拌器(600 r/min)中搅拌1.5 h,使其充分反应,最终制备的脂质体称为复合脂质体。

1.3.3 脂质体粒径、Zeta电位、多分散性系数的测定

在25 ℃,使用Zeta电位仪测量脂质体的粒径、Zeta电位和多分散性系数(PDI)。在测量前,将脂质体在蒸馏水中稀释10倍,使激光散射衰减度(Attn)值为5～10。

1.3.4 脂质体的颗粒形态观察

将样品稀释5倍,并将1滴样品滴在碳网上,待样品风干后,用体积分数为2%的磷钨酸染色 5 min。将多余的样品用滤纸除去并在25 ℃下干燥。在加速电压为200 kV的条件下,用透射电子显微镜观察脂质体颗粒的形态。

1.3.5 脂质体稳定性的测定

将脂质体在黑暗中于密封容器中,4 ℃储存15 d,观察脂质体的变化。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的测定

准确称取适量的DPPH粉末溶解于体积分数为75%的乙醇溶液中,配制成0.1 mol/L的DPPH溶液,避光保存。每组样品各取1 mL加入离心管中,分别加入2 mL DPPH溶液,混匀后置于暗处,室温下反应30 min。以3 000 r/min离心10 min,使用分光光度计,在波长为517 nm下测定上清液的吸光度A。将1 mL的蒸馏水加入2 mL DPPH溶液中作为空白样品,测得吸光度A_空白;没有加入DPPH溶液时的样品测得吸光度A_样品。DPPH自由基清除率的计算方法见式(1)。

DPPH自由基清除率=[1-(A-A_样品)/A_空白]×100%。

(1)

1.3.7 细胞活力检测

采用MTT法检测游离姜黄素和EGCG悬浮液及空白脂质体、负载姜黄素和EGCG的脂质体和负载姜黄素和EGCG的复合脂质体对BV2小胶质细胞活力的影响^[19]。将BV2小胶质细胞培养在RPMI 1640培养基(含有10%胎牛血清和1%双抗)中,置于37 ℃、体积分数为5%的 CO₂培养箱中。待细胞密度生长至80%～90%时进行胰酶消化,细胞计数后,将其以1×10⁴个/孔密度接种于96孔板中。细胞贴壁后更换为含不同浓度姜黄素和ECCG的无血清培养基,将96孔板置于培养箱中孵育4 h,用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后加入含有2 μg/mL LPS的无血清培养基处理12 h。弃去旧培养基,每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL)溶液,将96孔板置于培养箱中继续孵育4 h,小心吸弃反应液。为了充分溶解蓝紫色甲瓒结晶物,每孔加入100 μL的DMSO,将96孔板置于摇床振荡10 min,选择波长560 nm,用多功能酶标仪测定OD值,并根据式(2)计算BV2小胶质细胞活力。

细胞活力=A_实验/A_对照×100%。

(2)

式(2)中,A_实验为实验组吸光度;A_对照为对照组吸光度。

1.3.8 细胞形态观察

将BV2小胶质细胞均匀地接种于6孔细胞培养板(1×10⁵～5×10⁵个/孔)中,置于细胞培养箱中培养。待6孔细胞培养板中的细胞贴壁后,吸弃旧培养基,添加含游离姜黄素和EGCG(CE)、空白脂质体(LIP)、负载姜黄素和EGCG的脂质体(CE-LIP)及复合脂质体(HA-LF-CE-LIP)的无血清培养基,置于37 ℃、5%CO₂恒温恒湿培养箱中孵育4 h。加入1 mL PBS溶液清洗后,加入含LPS(1 μg/mL)的无血清培养基处理12 h。处理结束后使用PBS溶液清洗一遍,使用光学显微镜在明场下观察BV2细胞的形态。

1.3.9 细胞线粒体膜电势的检测

参照Liu等^[20]的方法,利用JC-1荧光染料检测细胞线粒体膜电势。由于线粒体内膜两侧的质子和其他离子浓度不对称,造成的电位差异即为线粒体膜电势(MMP)。细胞出现凋亡或损伤,使线粒体膜电势异常。按照JC-1试剂盒说明书所述方法测定MMP,采用红/绿荧光的相对比值衡量线粒体去极化的比例。

细胞前处理。将BV2小胶质细胞同时接种于6孔细胞培养板和96孔细胞培养板中。BV2细胞的处理方式同1.3.8。

细胞染色。待LPS处理细胞12 h后,吸弃培养基,用无菌PBS清洗一遍,加入1 mL细胞培养基。向6孔细胞培养板中加入JC-1染色工作液(每50万～100万细胞加入0.5 mL JC-1染色工作液,一般6孔板需要1 mL工作液),充分混合后再孵育20 min。孵育结束后吸弃上清液,用PBS洗涤2次。加入2 mL细胞培养基,在荧光显微镜下进行观察。

1.3.10 细胞内活性氧含量测定

参照Wang等^[21]的方法,采用DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧(ROS)含量。

细胞前处理。实验前将BV2细胞接种于6孔板中,BV2细胞所受的药物刺激处理方式同1.3.8。LPS处理细胞12 h后吸弃培养基。

探针加入及孵育。用无血清培养基将DCFHDA稀释为终浓度10 μmol/L,避光条件下将特异性荧光染料DCFH-DA探针加入无血清培养基中。于37 ℃孵育细胞0.5～1.0 h,为了使探针与细胞充分接触,间隔3～5 min轻轻摇晃混匀。

收集细胞。孵育结束吸弃培养基,用无血清培养基或无菌PBS清洗两遍,于荧光显微镜下拍照。

ROS含量测定。拍照后将细胞轻轻吹打下来,直至培养皿底部由半透明转为透明,细胞层几乎全部吹打到无血清培养基或无菌PBS中。将细胞悬液快速点入96孔板中,用荧光酶标仪进行荧光强度测定,设置激发波长为500 nm,发射波长为525 nm。

1.3.11 RNA的提取与逆转录

LPS处理细胞12 h后,将BV2细胞从37 ℃培养箱中取出,每加入1 mL Trizol试剂,按照说明书进行RNA的提取。用双蒸水调细胞RNA至统一浓度。按照康为世纪公司的mRNA反转录试剂盒的说明书,将样品稀释到所需浓度并与反转录试剂混合,利用普通PCR扩增仪将提取的mRNA反转录为cDNA。反转录程序:37 ℃持续15 min(反转录反应);85 ℃ 持续5 s(反转录酶的失活反应);冷却至室温,样品用无酶水稀释5倍,最终样品保存在-80 ℃条件下待用。

1.3.12 实时定量PCR测定

根据康为世纪公司的实时荧光定量PCR试剂盒(UtraSYBR One Step RT-gPCR Kit,无ROX)说明书中的操作顺序,配置20 μL反应体系,对样品进行实时荧光定量PCR。两步法PCR扩增标准程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,循环40次。小鼠源引物信息如表1,选择 GAPDH 为内参基因,采用2^-ΔΔCt相对定量法计算目的基因的表达变化。

表1 引物信息

Tab.1 Primer information

1.4 数据处理

使用GraphPad Prism 6.0软件对实验数据进行统计学分析,结果以平均值±标准偏差表示,两组间样本均值比较采取t检验,多组间用单因素方差分析,不同小写字母代表差异性显著。*表示与对照组相比差异显著(P< 0.05),**表示与对照组相比差异极显著(P< 0.01);#表示与LPS组相比差异显著(P< 0.05),##表示与LPS组相比差异极显著(P< 0.01)。

2.1 脂质体的制备与表征

2.1.1 不同条件对脂质体制备工艺的影响

脂质体的性质取决于其粒径、多分散性系数(PDI)和电荷特性。因此,探究了不同条件下磷脂与胆固醇比例、磷脂与Tween 80比例、水合时间及超声时间对脂质体的平均粒径、PDI和电势的影响。

2.1.1.1 磷脂与胆固醇比例的影响

平均粒径和PDI可反应体系的稳定程度,利用马尔文粒度仪对脂质体的粒径、PDI以及电位进行测定,实验结果见图1。磷脂与胆固醇是构成脂质体的主要成分,二者的比例会影响脂质体的质量。由图1可知,在所选浓度范围内,当磷脂与胆固醇的质量比例由2∶1变为6∶1时,脂质体的粒径急剧下降,这与之前的发现相似^[22]。这可能是由于胆固醇通过嵌入磷脂双层中增加了其有序性,促进其更紧密的包封,并且由于其在两个相邻的酰基链之间的存在而对自由基传播反应的扩散造成空间位阻。但是,当胆固醇的质量超过一定水平,就会开始破坏脂质体的双层结构,导致溶质分子被包裹。之前的研究也表明,胆固醇质量一定程度的降低会导致脂质体粒径的减小^[23]。当磷脂与胆固醇质量比从10∶1变为14∶1时,平均粒径无显著性差异。这表明,低于一定量的胆固醇对脂质体系统的粒径分布没有显著影响(P>0.05);而且,磷脂与胆固醇质量比由2∶1变为6∶1时,Zeta电位绝对值明显减小,之后在磷脂与胆固醇质量比为10∶1时显示出最大的Zeta电位绝对值,此时脂质体体系更稳定。因为在此条件下制备的脂质体显示出更优的平均粒径和PDI,因此,选择磷脂与胆固醇质量比为10∶1进行下一步研究。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图1 不同比例的磷脂与胆固醇对脂质体粒径、PDI和Zeta电位的影响

Fig.1 Effects of different ratios of phospholipids to cholesterol on particle size, PDI and Zeta potential of liposomes

2.1.1.2 磷脂与Tween 80比例的影响

磷脂与Tween 80的比例是影响脂质体性质的重要因素,探究了不同质量比的磷脂与Tween 80对脂质体粒径、PDI和Zeta电位的影响,实验结果见图2。从图2中可以看出,改变磷脂与Tween 80的质量比,脂质体的平均粒径都在80～120 nm,而随着Tween 80比例的升高,脂质体的粒径呈下降趋势,这可能归因于Tween 80提供的空间稳定性。推测Tween 80的烃链可以穿透脂质双层,暴露脂质体表面的聚乙烯氧化物基团,在脂质体表面引入空间屏障,从而减少脂质体的融合,这与之前的研究结果一致^[24-25]。脂质体平均粒径大小随着Tween 80比例的增加而减小,但对PDI没有显著影响(P>0.05);随着Tween 80比例的增加,Zeta电位绝对值先减小后趋于稳定。因为在磷脂与Tween 80比例为10∶3条件下制备的脂质体平均粒径和PDI最小,因此,选择磷脂与Tween 80质量比为10∶3进行下一步研究。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图2 不同比例的磷脂与Tween 80对脂质体粒径、PDI和Zeta电位的影响

Fig.2 Effects of different ratios of phospholipids to Tween 80 on particle size, PDI and Zeta potential of liposomes

2.1.1.3 超声时间的影响

选取超声时间分别为5、10、15、20 min,分析制备时间对脂质体的粒径、PDI和Zeta电位的影响,实验结果见图3。由图3可以看出,随着超声时间的增加,脂质体的平均粒径逐渐减小,在超声时间为15 min时,脂质体的粒径最小且同时具有最小的PDI值,此时的体系更稳定,分散性更好。这是由于超声可以使大的脂质体破裂成小的脂质体,这与之前的大蒜素纳米脂质体制备的结果具有相同的趋势^[26]。而随着超声处理时间的进一步延长,脂质体的平均粒径增加,这可能是由于超声的双重作用,超声通过对水/脂质的干扰引起脂质体的不稳定,导致脂质体聚集,从而使平均粒径增大^[27]。另一个原因可能是超声虽已成功地用于小的单层囊泡的形成,但是在一定程度后囊泡的大小不能进一步减小^[28],随着超声时间的增加,电位绝对值降低后趋于稳定。因此选择超声时间为 15 min 进行下一步实验。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图3 不同超声时间对脂质体粒径、PDI和Zeta电位的影响

Fig.3 Effects of different ultrasound times on particle size, PDI and Zeta potential of liposomes

2.1.1.4 水合时间的影响

磷脂的水合时间也是制备脂质体的关键因素,因此选择了水合时间分别为30、40、50 min,分析水合时间对脂质体的理化性质的影响,实验结果见图4。由图4可知,当水合时间由30 min变为40 min时,脂质体的平均粒径与PDI值急剧降低;当水合时间进一步延长,平均粒径和PDI均没有显著变化,而Zeta电位绝对值却在进一步减小。考虑到Zeta电位绝对值增加会增加体系的静电排斥作用,提高体系的稳定性,因此选择水合时间为40 min时进行脂质体的制备。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图4 不同水合时间对脂质体粒径、PDI和Zeta电位的影响

Fig.4 Effects of different hydration time on particle size, PDI and Zeta potential of liposomes

2.1.2 负载姜黄素和EGCG的脂质体制备条件的优化

姜黄素和EGCG作为被包裹的成分,研究其添加比例对脂质体理化性质的影响,有助于在体系中合理添加姜黄素和EGCG。设置磷脂与多酚的质量比例从14∶1到6∶1,探究不同磷脂和芯材的比例对体系粒径和电位的影响,实验结果见图5。由图5可以看出,多酚比例升高,脂质体粒径升高,随着多酚比例进一步增加,粒径呈现出先降低后升高的趋势。可以看出,在磷脂与多酚质量比例为10∶1时,脂质体的粒径最小,且具有较小的PDI值,具有更好的分散性;此时脂质体的Zeta电位绝对值更大,能有效阻止脂质体的聚集,脂质体更稳定。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图5 磷脂与多酚不同比例对脂质体粒径、PDI和Zeta电位的影响

Fig.5 Effects of different ratios of phospholipids to polyphenols on particle size, PDI and Zeta potential of liposomes

2.1.3 负载姜黄素和EGCG的复合脂质体制备条件的优化

2.1.3.1 乳铁蛋白添加量的影响

本研究中,选取了不同体积的乳铁蛋白修饰脂质体,实验结果见图6。由图6可知,在乳铁蛋白体积为0～0.3 mL时,随着乳铁蛋白含量的增加,脂质体的平均粒径先增加后降低。这可能是由于单一的脂质体体系不稳定,乳铁蛋白的添加抑制了脂质体的聚集,乳铁蛋白浓度增加,导致乳铁蛋白的修饰慢慢趋于饱和。当乳铁蛋白添加量为0.3 mL时,脂质体的平均粒径最低,此时的Zeta电位值趋于稳定,表明乳铁蛋白对脂质体的修饰达到饱和;当乳铁蛋白添加量大于0.3 mL时,脂质体粒径和Zeta电位都无显著变化。因此,选取0.3 mL的乳铁蛋白进行下一步研究。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图6 乳铁蛋白添加量对脂质体粒径、PDI和Zeta电位的影响

Fig.6 Effects of different additive amount of lactoferrin on particle size, PDI and Zeta potential of liposomes

2.1.3.2 透明质酸添加量的影响

选取不同体积的透明质酸,探究透明质酸添加量对脂质体粒径、PDI和Zeta电位的影响,实验结果见图7。由图7可知,随着透明质酸含量的增加,在添加体积由0.3 mL转变为0.5 mL时,脂质体的粒径显著降低;脂质体的电位值由正变为负;随着透明质酸添加量的进一步增加,脂质体的Zeta电位值没有显著差异,表明此时脂质体表面吸附的透明质酸已接近饱和。因此选择透明质酸体积为0.5 mL进行下一步实验。

小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图7 透明质酸添加量对脂质体粒径、PDI和Zeta电位的影响

Fig.7 Effects of additive amount of hyaluronic acid on particle size, PDI and Zeta potential of liposomes

2.1.4 复合脂质体的微观形貌观察结果

采用透射电子显微镜观察脂质体的微观形貌,实验结果见图8。由图8可以看出,所有的脂质体外观呈圆球形,脂质体未出现团聚结块现象,分散均匀。乳铁蛋白修饰后的脂质体平均直径增加,而在透明质酸修饰后,脂质体的平均直径呈现明显的增加,整体结果与动态光散射(DLS)测量值相比略小,这可能是因为在电镜样品制备过程中脂质体脱水导致的。

图8 透射电镜下的脂质体的形貌

Fig.8 Morphology of liposomes under transmission electron microscopy

2.1.5 复合脂质体的DPPH自由基清除率分析

为了进一步探究不同脂质体的抗氧化活性,对不同样品的DPPH自由清除率进行了测定,实验结果见图9。由图9可知,姜黄素和EGCG具有较强的DPPH自由基清除能力,空白的脂质体显示出较低的DPPH自由基清除能力。与混悬液中的姜黄素和EGCG相比,包封在脂质体中的姜黄素和EGCG显示出更高的DPPH自由基清除能力。这是因为包封可能会改善姜黄素和EGCG的分散性,使其在体系中更好地分散。乳铁蛋白和透明质酸修饰的包封姜黄素和EGCG脂质体的DPPH自由基清除率最高,这可能是由于乳铁蛋白和透明质酸本身具有的抗氧化活性也发挥了一定作用。

CUR+EGCG为CUR和EGCG的混悬液,LIP为空白脂质体,CUR/EGCG-LIP为共递送姜黄素和EGCG的脂质体,HA-LF-CUR/EGCG-LIP为透明质酸和乳铁蛋白修饰的共递送姜黄素和EGCG的脂质体。不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

图9 不同样品的DPPH自由基清除率

Fig.9 DPPH free radical scavenging rate of different samples

2.1.6 复合脂质体的稳定性分析

将不同脂质体置于4 ℃下贮藏,通过测定储存过程不同样品的外观变化,对不同脂质体的物理稳定性进行了评估,实验结果见图10。由图10可以看出,随着时间的推移,空白脂质体、CUR/EGCG-LIP、LF-CUR/EGCG-LIP的体系变化幅度较小, HA-LF-CUR/EGCG-LIP变化明显于其他组,可能是因为温度等环境因素使透明质酸与脂质体间的聚合网络结构发生改变,体系可能会出现团聚现象。从脂质体的直观图可以看出,新制备的脂质体体系澄清,复合脂质体在贮藏之后的外观没有显著的变化。

A为空白脂质体,B为负载姜黄素和EGCG的脂质体,C为乳铁蛋白修饰的负载姜黄素和EGCG的脂质体,D为乳铁蛋白和透明质酸修饰的负载姜黄素和EGCG的脂质体。

图10 新鲜制备和储存15 d后脂质体样品的外观

Fig.10 Appearance of samples at different storage times

2.2 复合脂质体对BV2小胶质细胞的干预作用

2.2.1 姜黄素和EGCG对LPS诱导的BV2小胶质细胞活力的干预作用

为了探究姜黄素和EGCG对LPS诱导的细胞活力的影响,分别用不同浓度的姜黄素和EGCG混悬液(0、20、40、80 μmol/L)处理BV2细胞4 h,实验结果见图11。由图11可知,姜黄素和EGCG混悬液对BV2小胶质细胞活力无明显影响,说明姜黄素和EGCG对BV2小胶质细胞没有毒性;LPS处理使BV2细胞的活力降低至75.80%,姜黄素和EGCG混悬液能够抑制LPS导致的细胞活力的降低;而80 μmol/L混悬液预孵可增加细胞活力至98.09%(P<0.05)。

CON为对照组,LPS为脂多糖干预组,CON+CE为对照组添加姜黄素和EGCG组,LPS+CE(20)为脂多糖添加姜黄素和EGCG(浓度为20 μmol/L)组,LPS+CE(40)为脂多糖添加姜黄素和EGCG(浓度为40 μmol/L)组,LPS+CE(80)为脂多糖添加姜黄素和EGCG(浓度为80 μmol/L)组。*表示与对照组相比差异显著(P<0.05),#表示与LPS组相比差异显著(P<0.05)。

图11 姜黄素和EGCG对LPS诱导的BV2小胶质细胞活力的影响

Fig.11 Effects of curcumin and EGCG on viability of LPS-induced BV2 microglia

2.2.2 对细胞形态的干预作用

研究表明,LPS干预小胶质细胞,能够诱导细胞产生炎症,进一步导致细胞凋亡^[29],不同处理对小胶质细胞形态的影响,实验结果见图12。由图12 可知,与对照组相比,LPS处理组的BV2小胶质细胞形态学变化明显,细胞分支明显变少,形态出现异常,这与之前的研究一致^[30]。空白脂质体处理对小胶质细胞的形态变化没有明显影响,而复合脂质体预孵育可明显抑制LPS诱导的细胞形态的改变,细胞分支显著增多,形态与对照组一致。

CON为对照组,LPS为脂多糖处理组,CE为CUR和EGCG混悬液,LIP为空白脂质体,CE-LIP为负载CUR和EGCG的脂质体,HA-LF-CE-LIP为透明质酸和乳铁蛋白修饰的负载CUR和EGCG的复合脂质体。箭头表示细胞分支,放大倍数为200倍。

图12 复合脂质体对LPS诱导的BV2小胶质细胞形态的影响

Fig.12 Effects of complex liposomes on cell morphology in LPS-induced BV2 microglia

2.2.3 对细胞线粒体功能紊乱的干预作用

在正常情况下,线粒体通过释放cAMP、Ca²⁺等第二信使参与细胞的多种信号转导过程,进而调节细胞内代谢系统的酶活性,而线粒体呼吸链则是ROS的主要生产场所,因此线粒体很容易受到ROS的攻击^[31]。进一步研究了复合脂质体对LPS诱导的BV2小胶质细胞线粒体膜电势的影响。

不同处理对LPS诱导的BV2小胶质细胞线粒体膜电势影响的实验结果见图13。由图13可知,与对照组相比,LPS处理显著降低了BV2细胞的红色荧光强度与绿色荧光强度比例,而乳铁蛋白和透明质酸修饰的负载姜黄素和EGCG脂质体可显著缓解LPS诱导的BV2小胶质细胞线粒体膜电势的降低。故LPS在诱导细胞炎症的同时造成了线粒体内膜两侧电势差缩小,产生了线粒体功能障碍,而复合脂质体干预后能够有效提升线粒体内膜两侧电势差,一定程度恢复线粒体功能。

CON为对照组,LPS为脂多糖处理组,CE为CUR和EGCG混悬液,LIP为空白脂质体,CE-LIP为负载CUR和EGCG的脂质体,HA-LF-CE-LIP为透明质酸和乳铁蛋白修饰的负载CUR和EGCG的脂质体。放大倍数为200倍。

图13 复合脂质体对LPS诱导的BV2小胶质细胞线粒体膜电势的影响

Fig.13 Effects of complex liposomes on mitochondrial membrane potential in LPS-induced BV2 microglia

2.2.4 对细胞氧化还原状态的干预作用

各种外源性或内源性刺激会促进机体 ROS 的过度释放^[32],复合脂质体对细胞内ROS产生的影响结果见图14。由图14可知:与对照组相比,LPS模型组极显著促进了细胞内ROS的产生(P<0.01);游离的姜黄素和EGCG的混悬液以及空白脂质体干预对于ROS的产生都没有显著的抑制作用(P>0.05);负载姜黄素和EGCG的脂质体处理则显著降低了细胞内ROS的产生;乳铁蛋白和透明质酸修饰的负载姜黄素和EGCG的脂质体预孵育使ROS含量已显著低于LPS模型组(P<0.05),与正常组相比没有显著差异。实验结果说明,复合脂质体能够显著降低细胞内ROS的产生。

CON为对照组,LPS为脂多糖处理组,CE为CUR和EGCG混悬液,LIP为空白脂质体,CE-LIP为负载CUR和EGCG的脂质体,HA-LF-CE-LIP为透明质酸和乳铁蛋白修饰的负载CUR和EGCG的脂质体。放大倍数为200倍。**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01),#表示与LPS组相比差异显著(P<0.05)。

图14 复合脂质体对LPS诱导的BV2小胶质细胞内ROS水平的影响

Fig.14 Effects of complex liposomes on reactive oxygen species levels in LPS-induced BV2 microglia

2.2.5 对细胞炎症因子的干预作用

LPS是构成革兰氏阴性杆菌细胞壁的成分,小胶质细胞是 LPS 的主要靶细胞, LPS 可以激活小胶质细胞并使其分泌大量的炎性细胞因子。复合脂质体对细胞炎症因子影响的实验结果如图15。由图15(a)可知,LPS 能够显著促进促炎因子IL-1β的mRNA表达,而复合脂质体干预可以显著抑制这一过程(P<0.01);但由图15(b)可知,复合脂质体对TNF-α的mRNA表达没有显著影响。另外,如图15(c)所示,复合脂质体明显抑制了LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症标志性蛋白COX-2的mRNA表达(P<0.01);而由图15(d)可知,炎症性标志蛋白iNOS的mRNA表达没有显著变化。综上,复合脂质体抑制了LPS诱导的BV2小胶质细胞的炎症反应。

CON为对照组,LPS为脂多糖处理组,CE为CUR和EGCG混悬液,LIP为空白脂质体,CE-LIP为负载CUR和EGCG的脂质体,HA-LF-CE-LIP为透明质酸和乳铁蛋白修饰的负载CUR和EGCG的脂质体。放大倍数为200倍。*表示与对照组相比差异显著(P<0.05),#表示与LPS组相比差异显著(P<0.05)。

图15 复合脂质体对 LPS 诱导的BV2小胶质细胞炎症因子的影响

Fig.15 Effects of complex liposomes on inflammatory factors in LPS-induced BV2 microglia

本研究主要通过薄膜超声法制备了负载姜黄素和EGCG的脂质体。通过调整磷脂和胆固醇比例、磷脂和吐温80比例、水合时间以及超声时间,对脂质体的制备工艺进行了优化。电镜观察结果显示,制备的脂质体呈均匀的球形,乳铁蛋白和透明质酸修饰后的复合脂质体稳定性显著提高,且具有更高的DPPH自由基清除率。复合脂质体能够显著抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞的线粒体膜电势的降低,改善细胞的线粒体功能障碍。LPS处理使BV2小胶质细胞的活性氧过度产生,经复合脂质体干预后,小胶质细胞活性氧含量显著降低,炎症相关因子的表达减弱,细胞炎症情况得到改善。姜黄素和EGCG具有极高的生物活性,在食品领域具有广阔的应用前景。各种运载体系的构建有助于提高姜黄素和EGCG的稳定性,但是现有的稳态化技术仍处于初步研究阶段,更绿色、更智能的体系亟待研究和探索。

制作：路旭东

编辑：张逸群、李宁

审核：叶红波