上海中医药大学附属龙华医院
介绍：
慢性疼痛是一种持续超过12周的长期疾病，包括神经性疼痛和炎症性疼痛;这种多方面的情况涉及主观感觉和情感成分（Mills et al.，2019;Pitzer et al.，2019）。抑郁症经常与多种临床情况同时发生，导致具有挑战性的疾病预后（Read et al.，2017）。在被诊断患有抑郁症的个体中，慢性疼痛的发生率在51.8%到59.1%之间（Corruble & Guelfi，2000），而慢性疼痛患者的抑郁症患病率可能高达85%（Doan等人，2015）。慢性疼痛和抑郁症的共存已被证明是相互加强的，导致疾病恶化和治疗挑战（Haleem，2019 年）。作为一项重要的全球疾病负担，慢性炎症性疼痛 （CIP） 与抑郁症之间的关联引起了人们的关注。CIP 导致受炎症反应影响的抑郁症神经生物学过程的激活增强（Guo 等人，2023 年;Pinho-Ribeiro et al.，2017）。几项研究阐明了两种情况的共同生物途径和分子机制，包括神经递质、神经炎症因子、脑源性神经营养因子（BDNFs）、中枢敏化、谷氨酸及其受体亚型（Lottering & Lin，2021;Meda等人，2022 年）。因此，了解 CIP 相关抑郁症（CIPD）的分子机制为其多样化的临床表现提供了潜在的靶点和解决方案。
慢性疼痛与伤害感受通路的适应不良变化密切相关，涉及异位动作电位和突触传递增加等异常现象。此外，神经可塑性改变，包括突触连接丧失、新突触回路的形成和神经免疫相互作用，也可能有助于其发展（Costigan et al.，2009）。突触可塑性在感知、评估和存储信息方面起着至关重要的作用，从而能够对刺激做出适应性反应。值得注意的是，突触可塑性成为短期和长期记忆过程中的关键决定因素（Duman et al.，2016）。同时，研究强调了慢性疼痛和抑郁症中共享的神经可塑性变化，揭示了它们的独特特征（Ru 等人，2022 年;Sheng et al.，2017）。这些研究的证据阐明，慢性疼痛会导致神经回路的神经可塑性改变，从而导致抑郁症状。然而，其潜在机制仍有待阐明。BDNF 是一种主要在大脑内合成的内在神经营养因子，在海马体和大脑皮层中表现出突出的表达（Du et al.，2020）。在功能上，它通过与受体酪氨酸蛋白激酶 B （TrkB） 的相互作用，在促进神经发生、神经元分化和突触可塑性方面发挥关键作用 （Lu et al.，2014）。BDNF/TrkB 信号级联反应的激活随后触发转录因子 cAMP 反应元件结合蛋白 （CREB） 的磷酸化 （Wang等人，2018 年）。几项研究提供了针对BDNF/TrkB/CREB信号通路在改善慢性疼痛和抑郁症状中的治疗潜力的证据（Price & Inyang，2015;Ye et al.，2017）。
共病慢性疼痛和抑郁的临床管理通常包括联合使用镇痛药和抗抑郁药。然而，这种治疗方法背后的协同机制仍然难以捉摸，长期药物使用引发了对依赖性和不良反应的担忧（Lottering &Lin，2021 年;Obata，2017 年）。因此，将 CIPD 视为一个统一的疾病实体有望开发安全可靠的治疗干预措施。电针 （EA） 需要对针灸针施加电流，与传统针灸相比，可以提高其治疗效果。它在全球范围内被广泛用于解决疼痛和情绪障碍（Wu et al.，2019）。临床前研究表明，EA 在缓解 CIPD 大鼠的疼痛症状和改善抑郁样行为方面具有疗效（Huang等人，2020 年;Liao & Lin， 2021）。此外，EA 可能通过调节 CREB-5-羟色胺 （5-HT）/BDNF 信号通路来改善慢性神经性疼痛和抑郁样行为（Cong等人，2021 年）。更重要的是，穴位 LI4 和 LR3 经常用于临床和动物实验，以控制慢性疼痛或抑郁症。这些点通过激活神经元和靶向特定的大脑区域起作用（Dias et al.，2016;Fan等人，2016 年;Gao等人，2023 年;Kasim & Viventius，2022;Luo等人，2017 年;Shan et al.，2014）。然而，EA 调节 BDNF/TrKB/CREB 信号通路治疗 CIPD 大鼠的确切机制仍然难以捉摸。基于突触可塑性改变发生在 CIP 大鼠的假设，我们假设 EA 可以通过上调 BDNF/TrKB/CREB 信号通路来调节海马突触可塑性，从而改善 CIPD。重要的是，这项研究的结果提供了有价值的实验证据，以支持 EA 作为 CIPD 患者的临床治疗方法。
材料与方法：
2.1. 动物
一些体重为 220-280 g 的8周龄雄性 Sprague-Dawley大鼠购自长沙天琴生物科技有限公司 [许可证号。SCXK （Xiang）2019‐0014]。将大鼠饲养在塑料笼子（每个笼子 5 只动物）中，在12小时的光照/黑暗循环下，可以自由获得水和食物。动物室保持在 23-25°C 的恒定温度范围和50%-60%的相对湿度范围内。所有大鼠在实验开始前适应1周，以尽量减少环境应激的影响。所有实验均经广西中医药大学机构福利与伦理委员会批准（批准号20220523-106）。将 60 只大鼠随机分为 4 组：0.9% 生理盐水（N.S.）、完全弗氏佐剂（CFA）、CFA + 度洛西汀（Dulox） 和 CFA + EA 组（每组 n = 15）。
2.2. CIPD 模型建立
CIPD 模型是根据 周 et al.（2019）和Shao et al.（2021.）方法建立的。在 2% 异氟醚 （RWD Biotechnology Co.，Ltd.）麻醉下，将大鼠置于俯卧位，第 0 天在左后爪足底表面注射 100 μL CFA （Sigma），然后在第 14 天使用显微注射器注射 50 μL。0.9% N.S. 组接受等效体积的 0.9% N.S. 注射。实验设计的过程如图1。
2.3. 电针和度洛西汀治疗
从第15天到第28天，模型大鼠接受 EA 和 Dulox 治疗。穴位和谷 （LI4） 和冲 （LR3）是根据已发表的文献双侧选择的 （Kang et al.， 2021）。使用无菌一次性针灸针 （0.25 mm × 13 mm），在吸入麻醉下将穴位插入 3-5 mm 的深度。然后使用 G6805-I 电子脉冲治疗仪（欣盛实业有限公司）连接同一侧的穴位，每次提供频率为 2/15 Hz、强度为 1 mA 的连续波，持续 20 分钟。LI4 和 LR3 的位置如图所示2.对于 Dulox 治疗，将 Dulox 盐酸盐胶囊 （H20150287， Eli Lilly and Company） 溶解在蒸馏水中，并以 10 mg kg 的胃内剂量口服给药。
和谷（LI4） 和太冲 （LR3） 穴位示意图
2.4. 机械撤离阈值（MWT）
使用改良的上下方法评估大鼠的机械撤离阈值 （MWT）（Chaplan et al.，1994）。将大鼠置于具有金属筛地板的聚丙烯树脂盒中，并在测试前适应 15 分钟。将一系列力度增加（0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 和 26.0）的 Von Frey 细丝垂直施加到左后爪中部的皮肤上。细丝的力量逐渐增加，直到它们形成“C”或“S”模式，如果大鼠表现出抬脚、或回避行为，则记录阳性反应。MWT 值使用以下公式计算：MWT = （10[Xf + kδ]）/10,000，其中 Xf 表示最后使用的细丝的力值;k 对应于查找表上与观察到的肯定响应匹配的值;δ 表示所用刺激物之间的平均差 （0.224）。
2.5. 热提取延迟 （TWL）
在用热板进行伤害性刺激之前，将大鼠置于覆盖有挡板的有机玻璃盒中 15 分钟以允许驯化。热诱导的撤爪潜伏期定义为从刺激开始到出现抬腿和回避的时间。每次刺激之间允许 10 分钟的间隔，以防止对热板过敏。在每项试验中刺激相同的位置，以确保结果的一致性。记录潜伏期并根据每只大鼠的3次连续测量进行平均。
2.6. 旷场测试 （OFT）
为了评估大鼠的运动活动和探索行为，本研究中使用了普通和黑色的旷野箱 （50 cm × 50 cm × 40 cm）。经过 15 分钟的适应期后，将每只大鼠置于盒子的中央区域，并使用摄像机记录它们的运动行为 5 分钟。使用 SMART 3.0 软件（Panlab）根据录制的视频计算在中心区域花费的时间和每只大鼠行进的总距离。
2.7. 蔗糖偏好试验 （SPT）
实验前，每组大鼠被训练在光线昏暗的安静房间里适应蔗糖水。在前24小时，每只大鼠给予两瓶含有等体积的1%蔗糖水以完成训练。在第二个24小时，用等体积的蒸馏水替换其中一个装有蔗糖水的瓶子，每只大鼠开始禁食。第二天，测量蔗糖水和蒸馏水的消耗量。蔗糖水偏好计算如下：蔗糖水偏好（%）= 蔗糖水消耗量（mL）/总液体（糖水+蒸馏水）消耗量（mL）× 100%。分别计算每组大鼠的糖水偏好率。
2.8. 强迫游泳测试 （FST）
强迫游泳测试（FST）是一种广泛使用的啮齿动物抑郁样行为评估方法。将实验大鼠置于水深约30 cm的无盖透明Plexiglas容器中，并保持在20 ± 2°C的恒定温度下。使用摄像机，在5分钟内记录每只大鼠的累积不动时间，其中不动定义为除了保持头部露出水面和鼻孔自由呼吸所必需的一些轻微的肢体运动外，没有所有肢体运动。测试后，每只大鼠立即干燥并放回笼子。
2.9. 尼氏染色 （NS）
用梯度醇溶液（75%、85%、90%和95%）对组织进行脱水后，使用冷冻切片机对组织进行切片。然后将切片与预热的甲苯胺蓝尼氏染色溶液孵育 20-40 分钟，然后用酒精梯度脱色（每步2分钟），并立即用蒸馏水洗涤30秒。最后，用中性树脂密封切片，并使用光学显微镜检查海马神经元的病理形态。
2.10. 透射电子显微镜 （TEM） 分析
海马组织最初用电子显微镜固定缓冲液固定并储存在4°C下。用0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后，使用1% O进一步固定组织SO4在室温下 2 小时。使用乙醇和丙酮的梯度方法促进随后的脱水，并且实验组织最终包埋在 SPI-Pon812 填料中。使用超薄切片机进行超薄切片（50–70 nm），所得组织切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅双重染色。然后使用电子显微镜（HT7700，Hitachi）观察和研究海马神经元突触的超微结构改变。随后，使用 ImageJ 软件评估突触结构。
2.11. 酶联免疫吸附测定 （ELISA）
通过使用通用的 5-HT 酶联免疫吸附测定 （ELISA） 试剂盒 （E-EL-0033，Elabscience） 和大鼠 GABA ELISA 试剂盒 （H168，南京建成） 测量海马血清素 （5-HT） 和 γ-氨基丁酸 （GABA） 水平。首先用预冷的 PBS 洗涤组织，称重并夹住，得到 50 mg 的海马组织。然后使用玻璃匀浆器在 450 μL PBS 中对组织进行匀浆，并在 4°C 下以 5000 ×g 离心 10 分钟。向每个标准孔和样品空白孔中加入样品稀释剂（50 μL），然后加入 50 μL 相应的组织样品。接下来，向每个孔中加入 100 μL HRP 偶联试剂，在 37°C 下孵育 45 分钟，然后每孔加入100 μL酶偶联物工作溶液，然后在 37°C 下孵育30分钟。最后，向每个孔中加入50 μL终止液，并通过酶标准化仪器测量450 nm 处的 OD 值。根据相应的标准曲线计算海马组织内GABA和5-HT的浓度。
2.12. 紫外比色法 （UCM）
总蛋白质含量的测量可以更精确地计算和表达谷氨酸（Glu）递质浓度。为了评估Glu的水平，根据制造商的说明，分别使用Glu测定试剂盒和总蛋白测定试剂盒（A074-1-1、A045-2-1、南京建成）。简而言之，称取50 mg大鼠海马组织，加入 450 μL 0.9% N.S. 中，在冰浴中进行机械匀浆。然后将匀浆以 2500 rpm 离心10分钟，并分析总蛋白水平。此外，收集 0.2 mL 上清液，同时加入0.6 mL试剂I。然后以 3000–3500 rpm 的转速对混合物进行进一步的离心步骤10 min，并分析0.5 mL上清液中的谷氨酸。使用紫外-可见分光光度计 （GENESYS5， Milton Roy Company）测定 Glu 浓度。
2.13. 蛋白质印迹 （WB） 分析
取约 50 mg 海马组织，研磨并加入 RIPA 裂解物 （R0020， Solarbio Co.， Ltd.） 中，然后在 4°C 下匀浆和随后离心。然后通过 BCA 方法对收集的上清液进行蛋白质含量测定。用 10% SDS-PAGE 分离 20 μg 样品蛋白，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜（IPVH00010，Millipore）上，然后用 5% 脱脂牛奶在含有 0.1% 吐温-20 （TBST） 的 Tris 缓冲盐水中密封 1 小时。然后将抗突触后致密蛋白 95 （PSD-95）（1：1500，DF12274，亲和）、抗突触核蛋白 （Syn）（1：1000，AF0402，亲和）、抗 BDNF（1：1200，AB108319，Abcam）、抗 TrKB（1：1000，AF6461，亲和）、抗 CREB（1：1000，AF3189，亲和）和 β-肌动蛋白（1：6000，AF7018，亲和）在 4°C 下孵育过夜。然后用 TBST 洗涤膜，每次洗涤 10 分钟，共洗涤 3 次，然后在室温下与辣根过氧化物酶偶联的抗兔二抗（ZB2301、ZSGB-BIO）进一步孵育 90 分钟。用 TBST 进一步洗涤后，使用增强的化学发光检测免疫反应条带，并进行蛋白质条带分析以利用 ImageJ 软件（美国国立卫生研究院）获得靶蛋白条带/β-肌动蛋白条带的相对蛋白质含量的灰度值。
2.14. 定量实时 PCR （qRT-PCR） 检测
使用 Trizol 方法从每只大鼠 100 mg 海马组织中提取总 RNA。简而言之，将组织在液氮中研磨，加入 1 mL Trizol，然后匀浆并沉降 5 分钟。接下来，加入 0.2 mL 氯仿，并将混合物在4°C下以 12,000 ×g 离心 15 分钟。然后将上清液（0.5 mL）转移至干净的 1.5 mL 离心管中，与 0.5 mL 异丙醇混合，并在 4°C 下以 12,000 × g 再次离心10分钟。弃去上清液，用 1 mL 75% 乙醇洗涤沉淀物，然后在 65°C 的金属浴中干燥。加入 DEPC 水溶解 RNA，并使用超微量核酸检测器测量浓度。根据逆转录试剂盒的说明将总RNA逆转录为 cDNA。qRT-聚合酶链反应（PCR）的引物序列列于表中1，反应程序为 95°C 预变性 30 秒，然后是 95°C 10 秒和 60°C 30 秒的 40 个循环。完成后，通过 PCR 仪器检测每个反应孔的比较阈值（Ct）循环，并使用2计算 BDNF 和 TrkB mRNA 的相对表达−ΔΔ Ct方法，以 β-肌动蛋白基因作为内部参考对照。
结果：
3.1. EA 减轻 CFA 诱导的大鼠机械和热痛觉过敏行为反应
足底区域注射 CFA 可迅速减少机械痛觉和热痛觉过敏，表明伤害性敏感的开始。在这项研究中，EA 在 CIPD 大鼠的机械和热痛觉过敏方面引起了显着改善。如图3a，b，CFA 注射前所有组的 MWT 和热撤爪潜伏期 （TWL） 的基线水平相似（p > .05。与 0.9% NS 组相比，MWT 和 TWL 在诱导后第 7 天和第 14 天均显着降低（p < .01。从第 15 天到第 28 天，EA 刺激导致 CIPD 大鼠的 MWT 和 TWL 显着增加（p < .01）。值得注意的是，在第28天，与 CFA + Dulox 组相比，CFA + EA 组在 MWT 和 TWL 方面的改善显着更大 （p < .05）。这一发现表明，与 Dulox 相比，EA 对 CIPD 大鼠可能具有更好的长期镇痛作用。
电针 （EA） 改善慢性炎症性疼痛抑郁症 （CIPD） 大鼠的痛觉过敏和抑郁行为。（a） 各组大鼠机械撤离阈值 （MWT） 在多个时间点的变化;（b） 每组大鼠在多个时间点的热 PAWS 撤退潜伏期 （TWL） 的变化。数据表示为平均值±平均值 （SEM） 的标准误差 （n= 15）。p < .01 与 0.9% 生理盐水 （NS） 组相比; p < .01 与完整的弗氏佐剂 （CFA） 组相比;**##Δ p < .05 与 CFA + 度洛西汀 （Dulox） 组。（c） 大鼠在开阔场地中行进的总距离;（d） 在空地中大鼠中心区域花费的时间;（e） 每组大鼠的蔗糖偏好;（f） 在强迫游泳测试 （FST） 中不动的持续时间。数据表示为 SEM ±平均值 （n = 5）。p < .01 与 0.9% N.S. 组; p < .01 与 CFA 组。**##
3.2. EA 减轻 CIP 诱导的大鼠抑郁样行为
已知慢性和持续的炎症性疼痛会诱发抑郁样行为。为了评估这些行为的程度，我们进行了三个行为实验：旷场试验（OFT）、蔗糖偏好试验（SPT）和FST。如图所示3c-f，所有组在 OFT 、 SPT 和 FST 中均显示出相似的基线水平 （p > .05）。到第 14 天，与 0.9% N.S. 组相比，CFA 组表现出显着的抑郁行为，证实了 CIPD 模型的成功建立。到第 28 天，与 0.9% NS 组相比，CFA 组显示总行进距离和在中心区域停留的时间显着增加，SPT 中的蔗糖消耗减少，FST 期间的不动时间增加（p < .01）。与 CFA 组相比，CFA + Dulox 和 CFA + EA 组在 FST 中的不动时间减少，同时 CIPD 大鼠的总行进距离、在中心区域的停留时间和蔗糖摄入量显着增加（p < .01）。
3.3. EA 改善形态学异常并保留神经细胞和CIPD大鼠海马体的突触超微结构
我们对 0.9% NS 组和 CFA 组的海马神经元进行了比较分析，以确定神经元形态的差异。0.9% N.S. 组未显示异常形态的迹象，神经元结构清晰，排列有序。相比之下，CFA 组表现出稀疏和受损的神经元，导致相当大的细胞损失。然而，在 CFA + Dulox 和 CFA + EA 组中，海马神经元都表现出细胞损失减少，其特征是细胞排列更整齐，细胞核更清晰（图4a).该证据支持 CFA + Dulox 和 CFA + EA 组对 CIPD 海马神经元的神经保护作用。
为了评估EA对海马形态结构的影响，我们采用透射电子显微镜观察突触超微结构。在0.9% N.S. 组中，突触小泡分布均匀，突触后密度或突触间隙未观察到显着变化。相比之下，CFA 组表现出突触小泡数量的减少、突触后密度的缩小和突触间隙的显着增加，表明神经信号受到抑制。然而，与CFA组相比，CFA + Dulox 和 CFA + EA 组均表现出突触小泡数量的增加、突触后密度增厚和突触裂隙的减少（图4b）。
3.4. EA 调节 CIPD 大鼠海马体中神经递质的含量
神经递质在长期海马突触可塑性中起重要作用，这被认为与慢性疼痛和抑郁有关（Palacios‐Filardo & Mellor，2019;Sheng et al.， 2017）。如图5，与0.9% NS 组相比，CFA 组显示海马体 5-HT 和 GABA 水平降低（p < .01），伴随着 Glu 水平的增加（p < .01）。EA和Dulox 处理显着增加了5-HT 和 GABA 的产生（p < .05，p < .01），同时减少了海马体中 Glu 的产生（p < .01）。
3.5. EA 上调 CIPD 大鼠海马体中突触相关蛋白的表达
突触相关蛋白，包括 Syn 和 PSD-95，在可塑性和炎症性疼痛中起着至关重要的作用（Yamada等人，2012 年;Zhang et al.， 2019）。在这项研究中，我们利用 western blotting （WB） 分析来评估海马突触相关蛋白的表达水平。如图所示6a-c，WB 分析显示，与 0.9% NS 组相比，海马组织中 Syn 和 PSD-95 的水平显着降低 （p < .01）。然而，用 EA 和 Dulox 治疗导致 Syn （p < .05） 和 PSD-95 （p < .01） 水平显着增加。此外，我们利用免疫荧光 （IF） 染色来检查海马体中突触相关蛋白的表达。同样，如图6天 - 克，IF 染色显示与 0.9% NS 组相比，CFA 组的 Syn 和 PSD-95 水平显着降低 （p < .01）。相比之下，与 CFA 组相比，CFA + Dulox 和 CFA + EA 组的突触相关蛋白表达水平均表现出显着增加 （p < .01）。
3.6. EA 激活 CIPD 大鼠海马体中的 BDNF/TrKB/CREB 信号通路
最近的研究已经确定了突触可塑性与 BDNF/TrKB/CREB 信号通路之间的联系（Wang等人，2023 年;Zhao et al.， 2021）。此外，增加其表达已显示出改善抑郁和慢性疼痛症状的前景（Cong et al.， 2021）。在这项研究中，WB 分析结果表明，与 0.9% NS 组相比，CFA 组海马中 BDNF 、 TrKB、p-TrKB 和 p-CREB/CREB 蛋白的表达水平显着降低 （p < .01）。然而，用 Dulox 和 EA 处理有效地逆转了这种抑制作用，恢复了 BDNF、TrKB、p-TrKB 和 p-CREB/CREB 蛋白的表达水平（p <.01，p <.05）（ 图7a-e).此外，qRT-PCR 测定显示，与 0.9% NS 组相比，CFA 组海马中 BDNF mRNA 和 TrKB mRNA 的表达水平显着降低 （p < .01）。值得注意的是，与 CFA 组相比，Dulox 和 EA 处理都导致 BDNF mRNA 和 TrKB mRNA 的表达水平显着增加 （p < .01）。这些发现表明，EA 有可能上调 CIPD 大鼠海马中 BNDF/TrKB/CREB 信号通路的表达。
慢性炎性疼痛是一种顽固性疾病，发生于周围神经损伤和组织炎症之后。大量研究表明，慢性疼痛影响着全世界无数的人，并已成为一个主要的公共健康问题，尤其是老年人。针刺疗法是我国传统医学瑰宝，而电针(EA)是针刺与现代科技相结合的治疗手段，具有安全方便、伤害性小、无副作用以及疗效好等优点，已在全世界被广泛用来治疗疼痛。电针镇痛效应涉及神经、体液、细胞信号转导等诸多机制，电针镇痛调节机制目前已成为研究热点。BDNF/TrkB信号通路作为神经元生长、发育和突触可塑性的关键调节器，广泛参与中枢神经系统疾病的发生发展，如缺血性脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病和脊髓损伤等。研究表明针刺能调节BDNF/TrkB信号通路的活性，对以上疾病具有显著的治疗潜力，其作用机制与参与突触结构重塑，抑制神经细胞凋亡，促进神经发生和突触再生等有关。尽管本研究对我们理解这种现象有很大帮助，但必须强调的是，通路抑制剂并未用于反向验证，因此我们无法明确确定该信号通路在疾病进展和管理中的确切贡献，导致获得的结果存在一定程度的不确定性。
编译：丁迪卿
述评：彭生
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