维生素D在改善七氟醚麻醉致老年小鼠认知功能障碍中的作用

1长治医学院附属长治市人民医院疼痛科，长治 046000；2天津医科大学总医院麻醉科，天津 300052

长治医学院附属长治市人民医院临床基础创新研究项目（2022A023）

【论著】

本研究通过对不同水平维生素D（VD）老年小鼠七氟醚麻醉后海马区氧化应激水平及突触素（SYN）和突触后致密蛋白‑95（PSD‑95）的表达进行比较，并结合行为学测试，评价VD对七氟醚麻醉后老年小鼠认知功能的作用。

1.1　实验动物与分组

本研究将40只12月龄C57BL/6J小鼠随机分为4组（每组10只）：对照组（C组）、正常老年小鼠+七氟醚组（S组）、VD（+）老年小鼠+七氟醚组［VD（+）组］和VD（−）老年小鼠+七氟醚组［VD（−）组］。

1.2　模型制备

参照文献使用100 ng/kg骨化三醇于每日上午对VD（+）组老年小鼠进行灌胃处理。１个月后（预实验时，每月采血１次，与正常老年小鼠进行比较，最终发现灌胃1个月出现差别，正式试验时即选择灌胃1个月）内眦静脉取血，测量其中VD［25（OH）D3］含量，与正常老年小鼠比较差异有统计学意义，视为VD（+）老年小鼠造模成功。将老年小鼠鼠笼外部用遮光布帘遮盖，不含紫外线黄光灯照明，昼夜比12∶12，保持环境干燥通风，同时使用不含VD的特殊饲料喂养。2个月后（预实验时，每月采血1次，与正常老年小鼠进行比较，最终发现避光2个月出现差异，正式试验时选择直接避光饲养2个月）内眦静脉取血，测量其中VD［25（OH）D3］含量，与正常老年小鼠比较差异有统计学意义，视为VD（−）老年小鼠造模成功。

S组、VD（+）组、VD（−）组建立七氟醚麻醉模型：小鼠连续3 d于密闭环境中每天吸入3%七氟醚及60%O2 2 h。C组小鼠则置于七氟醚麻醉模型相同密闭环境，连续3 d，每天吸入60%O2 2 h。

1.3　水迷宫实验

模型建立成功后第3天进行水迷宫实验测试认知功能，包含定位航行实验及空间探索实验两阶段。第一阶段为定位航行实验，连续5 d，每日将小鼠分别从水迷宫池Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个象限中点，面朝筒壁置入水中，记录其找到平台并在平台停留5 s的游泳时间为逃避潜伏期。如不能在120 s内找到平台，则人为引导其找到平台，并使其停留20~30 s，同时记录本次逃避潜伏期为120 s。每只小鼠入水实验间隔20 min。第二阶段为空间探索实验，于测试第6天进行，撤掉平台，将小鼠从目标象限对侧象限中点面朝筒壁置于水中，统计并记录小鼠穿越平台次数。

1.4　VD含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量测定

水迷宫测试结束后当天，颈椎脱臼法处死小鼠，冰上分离脑组织提取海马组织，−80 ℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测海马组织中VD含量。应用SpecTM分光光度计，采用羟胺法、钼酸铵比色法、硫代巴比妥酸法，分别测定海马组织中SOD活性、CAT活性以及MDA含量，具体操作流程以试剂盒说明为准。试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.5　SYN、PSD‑95表达测定

采用免疫印迹法（Western blot）测定海马组织中SYN、PSD‑95表达。海马组织称重后加入含蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀法裂解缓冲液，超声波细胞研磨至匀浆状态，冰上裂解30 min，4 ℃低温离心机14 000 r/min离心15 min。取上清液，二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量后取30 μg蛋白上样，进行十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‑PAGE）、转模、封闭，漂洗后加入兔抗鼠SYN一抗、PSD‑95一抗、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗，4 ℃摇床孵育过夜。次日复温、洗膜后加入羊抗兔二抗，室温孵育2 h。洗膜后经电化学发光曝光显影，应用Gel‑pro测量光密度，以目的蛋白条带光密度值与GAPDH比值反映目的蛋白水平。

2.1　VD含量比较

与C组比较，VD（+）组小鼠海马组织中VD含量较高（t=3.73，P=0.004），VD（−）组小鼠海马组织中VD含量则较低（t=4.02，P=0.002），S组小鼠海马组织中VD含量差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

2.2　逃避潜伏期和穿越平台次数比较

与C组比较：S组与VD（−）组小鼠第2~5天逃避潜伏期较长（均P<0.05），穿越平台次数较少（均P<0.05）；VD（+）组小鼠第2天逃避潜伏期较长（P<0.05），第3~5天逃避潜伏期和穿越平台次数差异无统计学意义（均P>0.05）。与S组比较：VD（−）组小鼠第2~5天逃避潜伏期较长（均P<0.05），穿越平台次数较少（P<0.05）；VD（+）组小鼠第3~5天逃避潜伏期较短（均P<0.05），穿越平台次数较多（P<0.05）。与VD（+）组比较：VD（−）组小鼠第2~5天逃避潜伏期较长（均P<0.05），穿越平台次数较少（P<0.05）。见图2。

2.3　SOD活性、CAT活性及MDA含量比较

与C组比较，S组、VD（+）组和VD（−）组小鼠海马组织中MDA含量较高（t=8.06，P<0.001；t=3.53，P=0.005；t=20.63，P<0.001），CAT和SOD活性较低（CAT：t=4.19，P=0.002；t=2.38，P=0.039；t=6.59，P<0.001。SOD：t=4.65，P=0.001；t=2.33，P=0.001；t=7.95，P<0.001）。与S组比较，VD（+）组小鼠海马组织中MDA含量较低（t=4.96，P=0.001），CAT和SOD活性较高（t=2.63，P=0.025；t=2.42，P=0.036）；VD（−）组小鼠海马组织中MDA含量较高（t=13.79，P<0.001），CAT和SOD活性较低（t=3.01，P=0.013；t=2.69，P=0.023）。与VD（+）组比较，VD（−）组小鼠海马组织中MDA含量较高（t=18.51，P<0.001），CAT和SOD活性较低（t=5.79，P<0.001；t=5.51，P<0.001）。见图3。

2.4　SYN、PSD‑95表达比较

与C组比较，S组、VD（+）组和VD（−）组小鼠海马组织中SYN和PSD‑95表达均较低（SYN：t=6.85，P<0.001；t=4.20，P=0.002；t=12.86，P<0.001。PSD‑95：t=7.66，P<0.001；t=4.55，P=0.001；t=9.70，P<0.001）。与S组比较，VD（+）组小鼠海马组织中SYN和PSD‑95表达较高（t=3.20，P=0.009；t=2.83，P=0.018），VD（−）组小鼠海马组织中SYN和PSD‑95表达较低（t=4.12，P=0.002；t=3.71，P=0.004）。与VD（+）组比较，VD（−）组小鼠海马组织中SYN和PSD‑95表达较低（t=8.42，P<0.001；t=5.78，P<0.001）。见图4。

本研究采用水迷宫实验评价各组老年小鼠认知功能，结果显示，与C组比较，经七氟醚麻醉处理后的各组老年小鼠逃避潜伏期时间均明显延长，穿越平台次数下降，同时，氧化应激水平升高，提示七氟醚反复麻醉可导致老年小鼠氧化损伤，引起认知功能下降。

本研究结果显示，与C组比较，七氟醚麻醉处理后，各组老年小鼠SYN与PSD‑95表达明显下降，结合水迷宫实验结果，提示多次七氟醚麻醉可以导致突触可塑性下降，认知功能下降。

本研究显示，VD（−）组老年小鼠较S组氧化应激程度升高，同时SYN与PSD‑95表达明显降低，认知功能障碍受损也更为严重；而VD（+）组老年小鼠与S组比较，氧化应激水平下降的同时，SYN与PSD‑95表达明显增加，认知功能得到明显改善；证实VD可以通过抑制海马组织氧化应激，并增强突触可塑性，改善七氟醚麻醉后老年小鼠认知功能障碍。但同时本研究也存在一定的局限性，由于条件所限，未能观察到电镜下不同水平VD老年小鼠七氟醚麻醉后海马组织突触结构的改变。

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