不藏了!师兄做转染总是一把过,原因竟是……

学术   2024-09-10 17:00   上海  

师兄

师弟,听说你最近实验结果那叫一个惨,组会上还被老师狠批了,到底咋回事呀?

唉,最近在做 DNA 和 siRNA 的共转染,折腾一个月了,一次都没成功!你是怎么经常一把过的?

师弟

师兄

都是实践经验呀!我之前也是细胞转染效率很低,而且转染后细胞状态也很差,最后做 wb 时,看不到明显的蛋白表达,可把我愁坏了。

那你是怎么解决的?

师弟

师兄

后来我发现是转染试剂没选对,之前使用的转染试剂毒性大、与细胞的相容性不好,对 DNA 和 siRNA 的结合能力也不足,我换成lipofectamine LTX就改善多了。

谢谢师兄!但是这么好用的转染试剂一定很贵吧!

师弟

师兄

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转染实验其实并没有想象中简单,在实际操作当中,经常会遇到各种问题,如:核酸无法有效进入细胞,转染效率低;非特异性的细胞死亡或基因表达增加干扰实验结果的准确性和可靠性;预期的基因表达或抑制效果未实现......


想要获得完美转染效果,从准备到转染再到优化,不放过任何一个细节才能轻松拿捏,如下是学霸君总结的一些经验,希望能帮到大家~


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准备篇

选择合适的细胞系:根据实验目的和需求,选择适合的细胞系进行转染,不同细胞系对给定的转染试剂或方法反应各异。


确保细胞健康与活性:转染前细胞活性和整体健康状态是影响转染结果的重要因素,应至少有 90% 的细胞为活细胞,传代复苏时间应足够,一般推荐在转染前至少 24 小时传代细胞。


控制细胞汇合度:转染时细胞的最佳密度取决于细胞类型和转染技术,应根据转染细胞系确定最佳密度,确保细胞在转染时未达到完全汇合或处于静止期。


选择合适的培养基:根据细胞类型和转染方法选择最适合的培养基,使用新鲜的培养基,某些细胞系或原代细胞可能需要特殊的包被材料贴附培养板。


注意 siRNA 质量、储存和用量:siRNA 须不含合成试剂残留,避免反复冻融和污染,其最佳用量受靶基因产物性质的影响,需要针对每种细胞系优化。




转染篇

选择合适的转染方法和试剂:根据想要输送的载体(DNA、RNA 或蛋白质)以及要转染的细胞类型选择合适的转染方法,如阳离子脂质体介导的转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔等,并选择合适的转染试剂,如 Lipofectamine 3000、Lipofectamine 2000 等。


优化转染条件:

 磷酸钙 - DNA 共沉淀法:优化 DNA 的用量、细胞与共沉淀一同孵育的时间以及甘油或 DMSO 休克的使用和持续时间。

 阳离子脂质体转染:优化 DNA 用量、转染试剂与 DNA 的比例、脂质 - DNA 复合物的孵育时间以及加入复合物时的细胞密度。

 电穿孔法:优化脉冲电压、脉冲宽度和脉冲数量等电参数。


控制细胞在转染试剂 /siRNA 复合物中的暴露时长:敏感细胞暴露在转染试剂中几个小时后即开始死亡,若转染会引起过多细胞死亡,应在 8~24 小时后去除转染混合物,补充新鲜培养基。




优化篇

避免使用抗生素:在平板接种过程中以及转染后 72 小时内,避免使用抗生素,因为抗生素会在透化处理的细胞中积聚产生毒性。


使用优化的试剂转染 siRNA:选择专用的转染试剂来导入小 RNA,根据细胞类型使用优化的 siRNA 转染试剂和实验方案。


优化转染试剂的体积:转染试剂的体积是一个重要的优化参数,体积过少会限制转染,过多则会引起毒性,最终转染效率受与 siRNA 结合的转染试剂量的影响。


优化血清使用:一般而言,培养基中加入血清会促进 DNA 的转染,但在进行阳离子脂质体介导的转染时,需在无血清的情况下形成 DNA - 脂质体复合物,转染 RNA 时建议在无血清的情况下进行,以避免 RNA 酶污染。同时要控制不同品牌甚至不同批次血清的差异性。


不难看出,在进行细胞转染实验时,选择合适的转染试剂是至关重要的。Invitrogen™ Lipofectamine™ 转染试剂是全球科学文献最常引用的转染试剂,拥有300,000 多条引用记录,在性能方面远超同行 30 余年,备受赞誉!


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Lipofectamine™ 转染试剂盘点


根据不同实验类型,需要将不同的物质递送到细胞内,因此正确的了解您希望输送的物质是选择可靠转染产品的第一步。我们为您整理了对应的适合产品,您可按需选择,不走弯路~




一、适合用来递送 DNA 的转染试剂


DNA 递送:DNA 质粒的瞬时和稳定转染。DNA 递送用于研究基因功能和调控、突变分析和基因产物的生化特性,以及基因表达对细胞健康和生命周期的影响,同时也用于大规模生产蛋白质以便纯化和下游应用。



Lipofectamine 3000





Invitrogen Lipofectamine 3000 转染试剂是用于难以转染的细胞的最高效试剂。可定制的、高效的两管制配方使您能够根据特定细胞类型的需求进行灵活的转染,包括原代细胞、干细胞和癌细胞系。2020 年至今引用文献超过 50,000 篇。



Lipofectamine 2000




Invitrogen Lipofectamine 2000 转染试剂适用于需要可靠性的转染实验,使研究人员能够专注于更重要的变量。这种广谱的多功能性来自于简单的操作步骤和在多个应用中的良好适应能力。同时,Lipofectamine 2000 在共转递质粒 DNA 和 siRNA 方面效果非常好。2020 年至今引用文献超过 70,000 篇,远超其它同类产品。



Lipofectamine LTX





Invitrogen Lipofectamine LTX 转染试剂结合了高效率和细胞活率,通过简单的两管优化,实现了快速温和的 DNA 质粒递送。2020 年至今引用文献超过 4,000 篇。

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二、适合用来递送 siRNA 的转染试剂


siRNA 递送用于瞬时转染 siRNARNAi 可以促进基因沉默,可用于蛋白质功能和表型分析、功能恢复、通路分析、体内沉默和药物靶点发现等研究。



Lipofectamine RNAiMAX




Invitrogen Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂特别适用于 siRNA 介导的基因沉默实验,包括高通量应用。其专有的 RNAi 特定阳离子脂质配方能够稳健地将 siRNA 和 miRNA 传递到所有细胞类型中。简单快速的操作步骤可以适应较低浓度的 siRNA,从而实现更有效的基因沉默,最小化非特异性效应。


除此之外,lipofectamine LTX也是一款适用于 siRNA 递送的转染试剂。



三、适合用来共转染的转染试剂


共转染是一种重要的实验手段,用于研究多个分子之间的相互作用和调控机制,以及揭示细胞功能和表型的复杂性。


Lipofectamine 2000 和 lipofectamine LTX在共转染中有出色的表现,非常适用于此类实验。


此外,lipofectamine 大家族中还有专用于 mRNA 递送的lipofectamine MessengerMAX,递送 CRISPR-Cas9 的Lipofectamine CRISPRMAX,以及Neon NxT 电转染系统


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