2024年国自然基金项目结果在八月底发布！巨噬细胞以及更多免疫调节细胞连续多年霸榜国自然热点，相关的高分文章连续不断。新入学的师妹开始做巨噬细胞研究，现在还在苦恼如何巨噬细胞的分离和分化。
巨噬细胞是在天然免疫系统中具有吞噬作用的细胞，它们与中性粒细胞一起，最早对感染作出反应。巨噬细胞参与细胞碎片和病原体的识别、吞噬和降解，还在向T细胞提呈抗原以及诱导其他抗原呈递细胞表达共刺激分子等方面发挥作用，从而启动适应性免疫反应。还有，在炎症初期，它们通过释放细胞因子和趋化因子发挥重要作用，这些细胞因子和趋化因子反过来将其他免疫细胞募集到炎症部位。
本文介绍巨噬细胞的研究方法：巨噬细胞分离、体外分化及表征分析。巨噬细胞可以从全血样本中分离PBMC，或者诱导单核细胞分化为巨噬细胞，还可以从组织或肿瘤中制备成单细胞悬液，最终分离和分析巨噬细胞。同时，人和小鼠单核细胞系也有商业化的产品，包括RAW264.7细胞（小鼠白血病单核巨噬细胞）和J774A.1细胞（小鼠BALB/c单核巨噬细胞）。
单核细胞分离
当分析或处理来自组织或肿瘤的巨噬细胞时，通常制备组织或肿瘤切片或单细胞悬液。组织或肿瘤切片可直接用于免疫组织化学（IHC）染色和分析。为了制备单细胞悬液，需要解剖组织或肿瘤，然后进行酶消化。单细胞悬浮液可以直接用于细胞表面标记物的流式细胞术分析等方法。
当需要时，可以使用磁珠细胞分选试剂盒或流式细胞仪分选法（FACS）分离巨噬细胞。使用抗体磁珠分选细胞时，特异性抗体接合在分选磁珠上，细胞悬液会继续带有磁珠一起孵育。一旦磁珠上抗体与目标细胞的表面抗原结合，再洗去未结合的非目标细胞，就可得到与磁珠结合的目标巨噬细胞。通过流式细胞术（FACS）进行分离时，使用荧光染料偶联的流式抗体对细胞群进行染色，然后使用细胞分选仪对染色细胞进行分选，最终得到目标巨噬细胞。
当从全血中分析或处理巨噬细胞时，常用步骤是分离单核细胞并且将其分化为巨噬细胞。因此，这里有多种方法，包括密度梯度分离、磁珠细胞分选、流式细胞仪分选法（FACS）和Rotea逆流离心系统获得。例如，使用流式细胞仪分选或磁珠细胞分选试剂盒从PBMC悬液中分离CD14+单核细胞，建议采用eBioscience Magnisort Human CD14 Postive Selection kit （货号8802-6834-74）。
同时，利用Rotea 的逆流离心原理可通过物理方法从单采血中分离纯度较高的单核细胞组分。相比于其它分离方法，物理法对细胞本身的干扰要小得多且更具有成本优势。
更多信息可在赛默飞生命科学微信搜索“应用案例 – 细胞治疗/疫苗生产中使用Rotea分离单核细胞的应用”
巨噬细胞体外分化
有多种刺激/分化方式能在体外获得原代巨噬细胞或极化M1或M2巨噬细胞。如果不需要进一步分离单核细胞，则分离的PBMC可通过与含15%胎牛血清（FBS）的Gibco RPMI 1640培养基一起培养直接生成巨噬细胞。
分离的单核细胞可以使用特殊的分化培养基分化成原代巨噬细胞。例如，使用生长因子GM-CSF和M-CSF可以使单核细胞分化成巨噬细胞。可以在RPMI 1640培养基中刺激单核细胞，培养基中添加10% FCS和10ng/mL GM-CSF或10ng/mL M-CSF持续7天，能导致M1和M2巨噬细胞分化。再加入IL-4、IL-10或TGF-β等其他细胞因子，将有助于提高存活率。刺激后，巨噬细胞以细长形状粘附于培养皿表面。
另外，可以用不同的细胞因子先后刺激单核细胞来获得M1和M2极化巨噬细胞。用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养得到的细胞，随后用10ng/mL脂多糖处理24小时和50ng/mL IFN-γ以获得M1巨噬细胞或添加20ng/mL IL-4可获得M2/M2a巨噬细胞。用免疫复合物和IL-1b或LPS处理能促进M2b活化，加入IL-10、TGF-β或糖皮质激素则能促进M2c活化。
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表征分析
可以使用免疫组化染色或流式细胞仪分析其表型来识别巨噬细胞类型。
注：c表示为表达在细胞内。
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