流式细胞术中对细胞内的蛋白靶标染色，往往需要用到固定剂和破膜剂，其目的是为了固定细胞并给细胞膜穿孔，以便进行后续的染色和分析。这样可以保持细胞的形态完整性，使得细胞内的目标蛋白能够暴露出来，方便染色和分析，并且能够对细胞内蛋白进一步研究和分析。使用合适的固定破膜剂，可以在固定破膜的同时保留细胞膜蛋白上结合的荧光。
eBioscience™ 流式胞内固定破膜缓冲液主要包含两个组分：Intracellular Fixation Buffer，125 mL（单独货号00-8222-49），Permeabilization Buffer（10x），100 mL（单独货号 00-8333-56）
试剂配置
Intracellular Fixation Buffer：通常是2X，可直接等体积加入待固定的细胞体系中。
Permeabilization Buffer：产品为10X，需要使用去离子水稀释至1X使用。
在这里提醒大家的是，检测细胞核内的因子建议使用eBioscience™ Foxp3/转录因子流式固定破膜缓冲液（货号00-5523-00），后续我们也会介绍关于该产品的使用方法。
实验步骤
本实验方案是以1.5mL EP管为例
1. [可选]根据需要检测的胞内蛋白，选择合适的刺激条件对细胞进行预处理。点击实验步骤最后的往期内容：细胞因子流式实验方法，了解更多。
2. 制备单细胞悬液，将准备好的10^6个细胞置于100 μL PBS中。
3. [可选]根据样本种属及来源选择合适的Fc受体剂进行封闭。点击实验步骤最后的往期内容：封闭Fc受体，了解更多。
4. [可选]使用可固定细胞活性染料对细胞进行染色：使用1 mL PBS重悬细胞，向其中加入1 μL可固定死活染料，混合均匀后4°C避光孵育30 min。
5. [可选]对细胞表面标志物进行染色：使用Staining Buffer配制表面抗体预混液，每个样本需要50 μL的抗体预混液，使染色体系总体积约为100 μL，轻轻地脉冲涡旋混合，4°C避光孵育30 min。 点击实验步骤最后的往期内容：细胞表面流式染色，了解更多。
6. 最后一次洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全离解细胞团块，通常保留约100 μL残余体积。
7. 添加100 μL IC固定液来固定细胞，之后脉冲涡旋混合。
8. 室温条件下避光孵育20-60分钟。
9. 加入1 mL 1X破膜液，在室温下400-600 x g 离心5分钟。
10. 弃上清，重复上一步。
11. 将细胞沉淀重悬于100 μL 1X破膜液中，直接加入推荐量的直标一抗以检测细胞内抗原，并在室温下避光孵育20-60分钟。
12. 加入1 mL 1X破膜液，室温下400-600 x g离心5分钟。
13. 弃上清，重复上一步。
14. 将染色后的细胞重悬于适当体积的流式细胞染色液中，上机检测。
15. 结果分析：通过流式细胞术圈门规则分析蛋白表达情况。
结果分析举例：通过流式多色染色，检测经刺激后T细胞中IFN-γ，TNF-α和IL-17A等细胞因子的表达情况。
往期Dr.赛流式小课堂回顾
点击图片，查看流式染色细胞因子知识
点击图片，查看流式封闭Fc干货知识
点击图片，查看流式染色细胞表面蛋白知识
Question & Answer
问
破膜剂有沉淀、有不同颜色，是正常现象吗？
答
破膜剂内的沉淀通常是盐析出，不影响使用。由于颜色不在产品质检项目内，不同批次可能会出现颜色差异，但不影响产品性能。
问
细胞样本经过表面染色后是否可以保存在IC固定液里？
答
染色完成后我们建议尽快上机检测，如果实在来不及上机，可以将100 μL 样品与100 μL IC固定液（货号00-8222-49）混合，从而将样品保存在IC固定液中。
问
能否先对细胞进行固定破膜，然后再对表面和胞内标志物染色？
答
理论上来说可以，但是需要注意抗体的克隆号是否耐受固定/破膜处理，赛默飞探索了部分抗体不同克隆号的兼容性，扫码了解更多信息。
问
为什么固定破膜后，表面标志物的荧光丢失了？
答
如果抗体发生内化的话，可能无法检测到表面的标志物；此外如果固定破膜试剂中如果含醇类试剂（88-8824-00内的固定破膜剂是不含醇类试剂的），会有导致荧光淬灭的可能，尤其对于荧光蛋白类染料影响最大。因此，要使用含醇类试剂的固定破膜剂，表面染色尽量避免使用APC、PE和PerCP及其复合染料偶联的抗体。破膜操作后，可以继续使用含有荧光蛋白类偶染料联的抗体进行胞内标记。
*以上数据均出自赛默飞流式细胞术精品培训班，所用流式细胞仪为Attune™ NxT流式细胞仪。
流式细胞术是重要的细胞分析方法学，赛默飞世尔科技的Gibco、Invitrogen和Thermo Scientific产品品牌可提供从流式仪器到抗体和试剂的流式整体解决方案。其中Invitrogen eBioscience陪伴着每一代流式科学家和技术人员获得成果、共同成长，这些年来我们一起见证以Anti-FoxP3为代表的流式抗体深受喜爱、更多种类的流式荧光染料欣然上市以及现在有着更丰富的产品和工具，满足高校研究院、生物技术公司、药企等从早期基础研究到临床转化和生产等不同阶段的需求，加速生命科学行业的进程发展。
