T细胞激活是体外获取大量T淋巴细胞基础的实验手段之一，激活和扩增获得的T细胞可广泛应用于下游CAR-T、TCR-T等研究和治疗。生理状态下，TCR（T细胞受体）会与CD3γ, ε, σ和ζ形成一个大的复合物 (图1)。发生抗原提呈时，此复合物可能发生聚集、排阻去磷酸化的分子 、募集Lck（淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶）以及释放出包埋在膜内的CD3ζ分子等，进而刺激T细胞活化和增殖。
图1. T 细胞信号转导的正向调节[1]
点击查看大图
由于CD3ε亚基在T细胞表面相对容易被抗体识别和结合，因此商品化的T细胞激活抗体大多是针对CD3ε亚基的。与抗原提呈过程类似，在体外实验中，使用CD3ε的抗体，可以有效地模拟抗原-MHC复合物与TCR的结合，从而激活下游的信号传导通路。
除了CD3构象改变引起的第一信号，T细胞的完全活化还需要另一个共刺激信号（CD28介导的第二信号）。它通常与抗原提呈细胞表面的CD80/CD86分子作用，当然也可以用CD28抗体代替CD80/CD86来诱发第二信号。
图2. T 细胞刺激[2]
CD3/CD28抗体活化T细胞操作步骤
这里以激活小鼠脾脏淋巴细胞为例
步骤 I：抗体包被96孔板
在无菌 PBS 中制备 5-10 µg/mL anti-CD3（货号#16-0031-82）溶液。
Note：建议进行预实验，以确定其他浓度CD3抗体诱导细胞活化的功效。
将 50 µL 抗体溶液分配到96 孔板各孔中。对于未刺激的对照孔，添加 50 µL 无菌 PBS。
封口膜密封96孔板以避免液体蒸发，37°C下孵育2 h，或提前一天准备并在 4°C 下保存过夜。
添加细胞之前，取出50 µL抗体溶液。
用 200 µL 无菌 PBS 冲洗每个孔并丢弃 PBS。
重复上述步骤。
步骤 II：添加细胞
将准备好的细胞用完全培养基重悬为1-2x106/mL。
Note：建议滴定细胞密度（2-3x106细胞/mL至105细胞/mL）以实现最佳活化。
用 PBS 清洗孔后（上述步骤 6），向每个孔中添加 100 µL 细胞悬浮液（不同条件注意设置复孔）。
添加CD28抗体（货号#16-0281-82），使其终浓度为 2 ug/mL。
放入 37°C、5% CO2 培养箱中，孵育 2-4天。
Note：孵育时间需要根据实验需求进行优化，注意观察细胞状态和培养基颜色，及时更换新鲜培养基。
收获和处理细胞进行下游检测。
更多内容参考往期Dr.赛流式小课堂
点击图片，查看小鼠脾脏样本的流式制备
Question & Answer
问
上述抗体刺激方案可以将T细胞扩增多少倍？
答
一般来讲，至少几十倍的扩增倍数是可以实现的。但这同时也与细胞来源、状态，以及抗体浓度和激活时间息息相关。
问
抗原提呈的方法与用CD3/CD28抗体活化有什么区别？
答
利用抗原提呈方法活化的T细胞是某个抗原特异性的细胞，这部分细胞比例偏低，而CD3/CD28活化的T细胞是多克隆的，从而能够获得较多的T细胞。
问
在什么时间该给T细胞进行补液或者换液呢？
答
激活过程中，需每天观察细胞是否形成克隆团。可以对细胞进行计数，如果出现培养基变黄或细胞密度过高的情况，可吹散细胞克隆团后调整细胞密度至0.5-1×106/ml，离心重悬在新鲜培养基中。
问
如果我需要观察T细胞增殖能力，有哪些方案呢？
答
可以采用细胞计数的方法，也可以利用染料稀释法观察T细胞的增殖代数，推荐使用CellTrace细胞增殖检测试剂（例如Celltrace CFSE，货号C34554），此外利用Click-it EdU的方法也可以检测不同刺激条件下T细胞的增殖能力。
问
CD3/CD28磁珠激活与CD3/CD28抗体激活T细胞有什么区别？
答
磁珠提供了多价交联信号，通常激活强度较高且持续时间较长，能够更有效地模拟天然APC的作用，但价格较高，常用于需要高效激活T细胞的实验；抗体激活的操作相对简单，激活强度和持续时间可能相对较弱，适用于一般的T细胞激活实验。
其他可参考的T细胞刺激活化方法[3]
*ConA和PHA 作用机制类似，两者可以结合细胞膜蛋白上的糖基基团，诱发T细胞受体的交联，从而激活T细胞。
*辅助细胞：与APC细胞功能类似，为T细胞激活提供共刺激分子或者Fc受体（可提供抗体结合位点）。细胞来源可以是删除或未删除T细胞的其他免疫细胞组分。为避免辅助细胞的背景增殖，可以用细胞色素C或者γ射线进行处理。
流式细胞术是重要的细胞分析方法学，赛默飞世尔科技的Gibco、Invitrogen和Thermo Scientific产品品牌可提供从流式仪器到抗体和试剂的流式整体解决方案。其中Invitrogen eBioscience陪伴着每一代流式科学家和技术人员获得成果、共同成长，这些年来我们一起见证以Anti-FoxP3为代表的流式抗体深受喜爱、更多种类的流式荧光染料欣然上市以及现在有着更丰富的产品和工具，满足高校研究院、生物技术公司、药企等从早期基础研究到临床转化和生产等不同阶段的需求，加速生命科学行业的进程发展。
