什么是细胞因子？
细胞因子是一类分泌性蛋白质或多肽，它们在细胞间传递信号并调节细胞的生理和免疫功能。细胞因子在多种生物过程中发挥重要作用，包括细胞增殖、分化、存活、炎症反应和免疫应答等。
细胞因子在多种疾病发生和发展中发挥重要作用，细胞因子风暴（cytokine storm，CS）是一种全身性炎症反应，过度激活的免疫系统可能会导致炎症细胞死亡，从而进一步促进致病的细胞因子释放，最终造成全身炎症。因此，研究和理解细胞因子的功能和调控机制对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
图1. 细胞因子风暴机制示意图[1]
Karki R, Kanneganti TD. The 'cytokine storm': molecular mechanisms and therapeutic prospects. Trends Immunol. 2021 Aug;42(8):681-705. doi: 10.1016/j.it.2021.06.001.
如何刺激细胞因子表达？
细胞因子流式染色时，往往会发现染色的信号很弱，即便换成荧光强度高的荧光基团，效果也并没有太多改善。这通常是由于细胞因子本身表达低，同时也可能会因为其自身是分泌蛋白的特点被转运到胞外，进一步降低了细胞内的表达水平！考虑到这一点，对细胞因子染色前，往往需要对其先进行刺激。
对于细胞因子的刺激活化，通常是使用特定肽或非特异性激活混合物激活细胞，并添加蛋白质转运抑制剂以将细胞因子保留在细胞内。例如可以使用佛波醇（PMA）和离子霉素，来诱导细胞活化，产生细胞因子。同时，辅以Brefeldin A 和莫能菌素，来抑制细胞的蛋白转运功能，使刺激产生的细胞因子在细胞内蓄积。
图2.小鼠脾脏细胞未受刺激（左）或用细胞刺激混合物（加蛋白质转运抑制剂，货号：00-4975-93）（右）刺激 5 小时，流式染色检测细胞因子TNFα表达。
针对细胞因子的活化刺激试剂，我们不仅有上面提及的佛波醇（PMA）和离子霉素与Brefeldin A 和莫能菌素的混合物，也有多种单独组分及其他刺激剂可以提供。
如何染色细胞因子？
前面提到了，如何诱导刺激更多的细胞因子表达并使用蛋白转运抑制剂抑制细胞因子转运到胞外。而细胞因子流式染色，还需要对细胞进行固定和破膜处理后再染色。
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第一步 样品制备
在细胞因子流式染色过程中，需要对制备好的单细胞悬液先进行刺激活化细胞因子表达，才能进一步染色。在实验步骤结束处，点击往期Dr.赛流式小课堂-流式样本制备方法，了解更多内容。
第二步 死活染色（可选）
由于细胞因子的染色需要对细胞进行固定破膜处理，因此，我们只能选择胺反应性的死活染料，来兼容后续细胞固定破膜的操作。不同于核酸类的死活染料，胺反应性的死活染料主要是与细胞的蛋白伯胺基团进行标记。需要注意的是，这类胺反应性的死活染料，只兼容醛类试剂的固定处理。在实验步骤结束处，点击往期Dr.赛流式小课堂-流式细胞活性染料，了解更多内容。
第三步 Fc受体封闭（可选）
巨噬细胞、髓系细胞等细胞表面会有Fc受体，若是不经封闭，则可能会导致细胞出现高背景及假阳性等问题，Fc受体封闭可减少抗体的非特异性结合。在实验步骤结束处，点击往期Dr.赛流式小课堂-封闭Fc受体流式细胞活性染料，了解更多内容。
第四步 固定破膜
对于细胞因子染色，在使用蛋白转运抑制剂后，细胞因子在细胞质内出现积累。正常情况下，荧光标记的抗体无法通过完整的细胞膜进入细胞内，用流式细胞仪测定细胞内抗原，需先利用破膜剂破坏细胞膜的完整性，产生可供抗体通过的小孔。破膜效果的好坏将直接影响荧光染色和结果分析。市面上也有商品化的流式固定破膜缓冲液可以提供。
第五步 抗体染色
在对细胞进行固定破膜处理后，即可对细胞因子进行染色。通常来说商品化的流式抗体会提供建议用量，可先根据建议用量进行尝试。通常使用室温避光孵育30-60 min的条件。可以根据染色效果优化孵育温度和时间。
往期Dr.赛流式小课堂回顾
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点击图片，查看流式封闭Fc干货知识
完成了以上的五个步骤，我们就实现了对细胞因子的染色，后续可以对样本进行上机检测了。
Question & Answer
问
细胞因子染色时，涉及其他的表面抗体染色，可以一起做吗？
答
可以，但是通常需要先对表面抗体染色后，细胞固定破膜处理，再染色细胞因子。同时要做流式表面染色和细胞因子染色，通常大部分情况下，可以参考以下流程图。
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*以上数据均出自赛默飞流式细胞术精品培训班，所用流式细胞仪为Attune™ NxT流式细胞仪。
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流式细胞术是重要的细胞分析方法学，赛默飞世尔科技的Gibco、Invitrogen和Thermo Scientific产品品牌可提供从流式仪器到抗体和试剂的流式整体解决方案。其中Invitrogen eBioscience陪伴着每一代流式科学家和技术人员获得成果、共同成长，这些年来我们一起见证以Anti-FoxP3为代表的流式抗体深受喜爱、更多种类的流式荧光染料欣然上市以及现在有着更丰富的产品和工具，满足高校研究院、生物技术公司、药企等从早期基础研究到临床转化和生产等不同阶段的需求，加速生命科学行业的进程发展。
