为了增加论文数据的丰富性冲个一区，我导安排我补充一些免疫荧光结果，目标是完成核、骨架和3个目标蛋白染色。半个月搞下来染个稀碎......
导师：共聚焦拍照花了几千块了，图呢？
我默默展示失败的图片：有的通道背景太强了，3个靶点1个弱到看不到、1个强到瞎眼…
导师：赶紧的，文章月底投出去，不然一区上不去你还得延毕。
我流下悔恨的泪水，千不该万不该，不该不做功课就直接上机。
免疫荧光实验中信号和背景的问题总让人头大，特别是多个靶点和组织样品时问题更突出。同时，为了更好助力大家的实验，我们还针对多重+组织免疫荧光准备了保姆级实验方案，前100位下载实验方案，有机会获得网红实验室积木一套。快来扫描下方二维码参与吧！
首先，免疫荧光需要正确的操作流程，只有正确操作才能带来优秀的实验结果：
实验前准备：设计实验方案→挑选抗体→准备试剂
免疫荧光样品制备：细胞准备→固定→透化→封闭→免疫染色→封片
免疫荧光样品观察/成像：设置荧光显微镜→获取图像数据
图1. 免疫荧光样品前处理解析
如果你的操作与上面的流程和步骤操作一致，获取的图片中依然出现了目标分子信号很弱，或者背景特别高的情况，就需要进一步从步骤中找出导致失败的真正「黑手」：
问题一：免疫荧光信号弱
从样品本身、固定透化到抗体孵育，甚至是拍照，每一步都有可能是原因。
问题二：免疫荧光背景高
大家在操作时别忘了设置对照，这样能帮助我们迅速判断背景的来源。对照包括自发荧光对照（无一抗、二抗）和无一抗对照。
图2. 免疫荧光背景排查思路
问题三：二抗不会选
免疫荧光二抗的选择需要注意很多小细节，都是不可忽略的重点。
相信上面的内容，已经足够帮助你解锁免疫荧光的基础技能了。同时，赛默飞也为您准备了【进阶指南】，帮您升级拿下多重免疫荧光/空间组学的实验：
多重免疫荧光是一种进阶免疫荧光技术，可在单个组织切片中同时检测多种生物标志物。多重免疫荧光具有多种优势，尤其是在癌症免疫治疗领域[1]：
多重检测：多重免疫荧光允许在单个组织切片中同时检测多种生物标志物。
高分辨率：一些多重免疫荧光技术，例如多表位配体制图 (MELC) 和迭代漂白扩展多重性 (IBEX)，提供高分辨率成像，能够在细胞和亚细胞水平上详细分析蛋白质表达和相互作用。
高灵敏度：多重免疫荧光中的酪胺信号放大 (TSA) 等技术可以显著放大信号，从而可以检测低表达抗原。
灵活性：多重免疫荧光既可以应用于新鲜冷冻组织样本，也可以应用于福尔马林固定、石蜡包埋 (FFPE) 组织样本，为样本制备提供了灵活性。
空间信息：多重免疫荧光不仅提供有关特定生物标志物存在与否的信息，而且还提供有关这些标志物在组织内的位置的空间信息。这种空间背景对于理解细胞相互作用和疾病进展至关重要。
高级分析：多重免疫荧光可以与先进的计算机软件结合进行定量多路复用数据分析，这有助于在单细胞水平上理解组织微结构与表达之间的关系。
然而，值得注意的是，虽然 mfIHC 具有许多优点，但它也存在一些局限性，包括技术的复杂性、荧光团光谱重叠的可能性以及某些方法的高成本。下图简单总结了多重免疫荧光流程和重点。
图3. 多重免疫荧光流程和重点
为了更好助力大家的实验，我们还针对多重+组织免疫荧光准备了保姆级实验方案：
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*活动截至10/4日，礼品最晚将于10月下旬陆续寄出。
参考文献
1. Sheng, W., Zhang, C., Mohiuddin, T. M., Al-Rawe, M., Zeppernick, F., Falcone, F. H., Meinhold-Heerlein, I., & Hussain, A. F. (2023). Multiplex immunofluorescence: A powerful tool in cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences, 24(4), 3086. https://doi.org/10.3390/ijms24043086
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