细胞因子（cytokine,CK）是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。是由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。它们在细胞之间传递信息，调节细胞的生理过程，提高机体的免疫力，在异常情况下也有可能引起发烧、炎症、休克等病理过程。这样一大类因子已发现的有上百种，统称为细胞因子。主要的细胞因子种类包括：白细胞介素（interleukin ,IL）、干扰素（interferon ,IFN）、趋化因子(chemokine ,CK)、肿瘤坏死因子（tumor necroptosis factor ,TNF）、转化生长因子β (TGF-β)家族、集落刺激因子（colony-stimulating factor ,CSF）或生长因子（growth factor）。细胞因子参与机体免疫反应和炎症反应，是非常灵敏的炎症指标，在疾病发展过程中动态监测细胞因子水平，可及时发现疾病转重倾向，及时治疗、避免或降低病情的恶化风险，实现“治未重”，提高临床治疗有效率。
今天小编以一篇研究文章为例，告诉您ProcartaPlex 80-plex大Panel 是如何发挥免疫筛查功能。
本研究旨在全面分析镰状细胞病（sickle cell disease ,SCD）在稳态条件（steady-state condition ,StSt）下并与健康对照（healthy controls ,HC）相比稳态条件下镰状细胞病（SCD）患者与健康对照（HC）相比其的炎症和自身免疫特征，以探讨稳态条件下StSt的发病机制及其对患者健康的影响。
关于镰状细胞病（SCD）
镰状细胞病（SCD）是世界上较为常见的，也是最严重的遗传性血液疾病之一。主要特征为患者存在具有改变了形态和生物学特性的镰刀形红细胞。与正常的红细胞相比，镰刀形红细胞失去了变形和有效地通过毛细血管的能力，会导致阻塞和血流量减少。同时，为了弥补红细胞的损失，骨髓产生的网织红细胞水平升高，表达更高水平的表面粘附分子，促进网织红细胞与血管内皮细胞的结合，引起内皮细胞（EC）的活化和炎症分子的释放。这种病症可引起一系列并发症，包括急性和慢性疼痛、贫血、中风、肺动脉高压和器官损伤。因此，对SCD引起的炎症相关研究，对于医学发展与疾病控制具有重要意义。
Luminex多重免疫测定
SCD的特征在于持续的促炎状态，其导致血流中炎性介质水平升高。炎症介质是重要的信号分子，在疼痛、血管阻塞危象（VOC）的发展和SCD的发病机制中起着至关重要的作用。本文通过Luminex多重免疫测定（ThermoFisher ProcartaPlex™ 80-Plex 人免疫应答试剂盒，货号: EPX800-10080-901），对27例StSt和53例HC的血浆中80种人炎症细胞因子、趋化因子、生长因子、炎症受体、效应分子及18种人自身抗体、C反应蛋白（CRP）进行了检测。
经检测，SCD受试者的35种分析物的血浆水平显著高于HC（表1）。这些升高的分析物包括10种趋化因子（CCL21、CCL23、Eotaxin-2、Gal-3、GRO-α、IP-10、MCP-2、MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α），2种效应分子（granzymesA和B），9种生长因子（BAFF、bNGF、G-CSF、GM-CSF、HGF、IL-7、IL-20、IL-34和LIF），8种促炎细胞因子（IFN-γ、IL-1α、IL-2、IL-8、IL-9、IL-18、TNF-α和TNF-β），4种II型炎症/抗炎细胞因子（IL-4、IL-5、IL-6和TSLP）和2种免疫调节可溶性受体（PTX 3和TREM-1）。此外， VEGF-A和IL-17A在SCD受试者中表现出升高的趋势。经过多重比较校正后，SCD受试者的37个变化分析物中有9个仍然显著高于HC。其中包括4种趋化因子（CCL23、Gal-3、IP-10和MCP-2）、2种生长因子（HGF和IL-34）、2种促炎细胞因子（IFN-γ和IL-18）和可溶性受体PTX3。值得注意的是，与HC相比，这些变化的分析物中，HGF、IL-18、IP-10和MCP-2在SCD受试者中表现出最显著的上调。
此外，作者使用多重免疫测定法同时测量了18种人自身抗体的血浆浓度时，发现与HC相比SCD受试者中的4种自身抗体显著升高，包括干燥综合征相关抗原A/Ro 60 kDa（SSA/Ro 60）、核糖体P、髓过氧化物酶（MPO）和PM/Scl-100，（图1A，B）。经多重比较校正后，SSA/Ro 60和MPO在SCD受试者中仍显著较高（分别为p = 0.048和p = 0.022）。值得注意的是，其中SSA/Ro 60自身抗体通常被归类为ANA(抗核抗体)，而核糖体P、MPO或PM/Scl-100的自身抗体不被归类为ANA（非ANA）。因此，血液中的ANA和非ANA在SCD受试者中与HC相比显著升高。
经分析可知，与HC相比，SCD受试者的促炎细胞因子、趋化因子、生长因子、效应分子和可溶性受体升高，且ANA和非ANA均存在于SCD受试者中并显著升高。
表1. 通过Luminex多重免疫分析法检测SCD受试者中上调的炎症介质。
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图1 SCD受试者与健康对照者中自身抗体升高的数量和个体发生率的比较分析。(A)SCD受试者（n=40）与健康对照（HC，n=23）中18种血浆自身抗体水平。(B)散点图显示SCD受试者中4种自身抗体（抗SSA/Ro60、抗核糖体P、抗髓过氧化物酶和抗PM/Scl-100）的血浆水平与健康对照组相比显著升高。
流式细胞术评估
与此同时，本文作者使用流式细胞术评估来自SCD受试者的PBMC中的RBC/网织红细胞-白细胞聚集体（图2A）。新鲜分离的单个核细胞（PBMC)用CD45（在所有白细胞上表达的标志物）、CD 235 ab（在RBC及其前体上表达的标志物）、BCAM和CD 71（转移受体-1，RBC群体中网织红细胞的特异性标志物）抗体染色。如图2B所示，与HC相比，SCD受试者中总CD235abhiCD45+聚集体的百分比显著更高，且SCD受试者中CD71+网织红细胞聚集体的百分比显著更高（图2C，左图）。同时，与HC相比，SCD受试者中游离的CD 71+网织红细胞百分比也显著更高，表明SCD受试者中网织红细胞增加（图2C，右图）。类似地，与HC相比，SCD受试者中聚集体或未聚集的RBC上的BCAM表达显著升高（图2D）。这一结果表明，StSt PBMC样品含有较高数量的RBC或RBC前体，如网织红细胞，以及较高水平的细胞粘附分子BCAM，因此有助于聚集体的形成。与HC相比，SCD受试者中聚集体中CD 45+淋巴细胞的百分比较低，而单核细胞的比例提高（图2 E）。当分析和比较SCD受试者PBMC和聚集体中的免疫细胞类型时，相对于PBMC，聚集体中单核细胞较为丰富而淋巴细胞比例减少（图2F），表明RBC/RBC前体优先与聚集体内的单核细胞相互作用。
图2 SCD受试者与健康对照者中RBC/网织红细胞与CD 45 + PBMC聚集的比较。
炎症介质上调伴随自身抗体改变和红细胞/网织红细胞
-白细胞聚集形成的相关性分析
基于多重免疫分析以及流式细胞术分析结果，作者评估了表3中列出的37种升高的炎症介质（其中9种校正后p<0.05）、StSt受试者中SSA/ Ro60、核糖体P、MPO和PM/Scl-100自身抗体， 与RBC/网织细胞白细胞聚集形成之间的相关性（表2）。数据表明，在稳定状态下，炎症和自身免疫与红细胞与白细胞聚集形成密切相关。
表2 炎症介质上调伴随自身抗体改变和红细胞/网织红细胞-白细胞聚集形成的相关性
同时，相关性分析发现炎症介质和自身抗体与VOAs、疼痛强度和感觉敏感性显著相关（表3、表4）。
表3 炎症介质改变与VOC危机前后时间间隔的相关性
表4 SCD患者可溶性因子和自身抗体表达上调与PROMs、感觉敏感性的相关性
总结
SCD的特征是一种持续的促炎状态，导致血液中炎症介质水平的升高。炎症介质是一种重要的信号分子，在疼痛、VOCs和SCD的发病机制中起着关键作用。本研究使用ProcartaPlex 80-plex 大panel 观察到SCD受试者的血浆中80种分析物有37种表现出更高的表达水平，包括13种促炎/抗炎细胞因子、10种趋化因子、10种生长因子、2个效应物和2个可溶性受体。这表明，SCD受试者与HC相比发生了促炎反应。SCD受试者在StSt期，即使没有经历VOCs，也经历了持续的高水平的炎症介质。且一些炎症因子参与自身抗体的产生，与红细胞/网织红细胞-白细胞聚集也有关。在SCD中，炎症因子和RBC/网织红细胞-白细胞聚集体形成之间的相互作用，建立了复杂且有害的循环。炎症介质破坏免疫应答，导致RBC/网织红细胞与白细胞的聚集增加。
本文全面分析了稳态条件下SCD患者（StSt）的炎症和自身免疫特征，通过ProcartaPlex多重检测对炎性细胞因子/趋化因子/生长因子进行检测以及自身抗体谱分析、通过流式细胞术对细胞聚集率的检测，探讨StSt的发病机制及其对患者健康的影响。通过相关性分析确定了炎症介质水平、自身抗体、RBC/网织红细胞聚集、临床实验室检查结果和疼痛危象/敏感性之间的相关性，揭示了这些因素之间复杂的相互作用。这些发现强调了特异性生物标志物和治疗靶点的潜在意义，可能为未来的研究和临床干预带来希望。
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ProcartaPlex™ Human Immune Response Panel, 80plex
本文中使用了ProcartaPlex™人免疫应答80-Plex 检测组合（货号: EPX800-10080-901），仅用25μL血浆样本，单孔同时检测80种炎性细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体和效应分子。使用该组合可进行高效的免疫应答分析、生物标记物发现和验证。
80种靶标列表
赛默飞生命科学
