我们所有的争论，是为了“分高下”吗？
10月18日下午，京港感染论坛会议现场。
我们迎来了第一个真正意义上的、由检验专家执笔、临床专家深度参与的“靶向高通量测序在感染性疾病中的应用与实践”专家共识。
作为见证了tNGS从诞生到繁荣再到如今乱战的深度参与者，我的内心百感交集。
共识中的不少建议和观点，既让我想起了个人过去三年在该领域的实践经验，也给到了我一些新的启发。
在这里斗胆做个解读，旨在抛砖引玉，和大家一起推动tNGS的合理临床应用。
如何定位tNGS？
多重扩增 or 探针捕获？
mNGS何去何从？
01
如何定位tNGS？
和mNGS产品的“全面覆盖”不同，tNGS从诞生之初，就定位“小而美”。
这个“小”有两层意思：
第一层是“少”，通过更少的检测靶标来降低成本，减轻支付的经济负担。
第二层是“精”，针对不同感染系统或部位的病原流行病学规律，确定打靶病原范围。
而第二层是我认为tNGS能够独立成为一个品类的关键。
有些朋友说mNGS和tNGS的差异是在“无需预测” vs “相对预测”，这当然是对的。
但我更倾向于这二者只是把“预测”的时间点进行了调整：
mNGS将“预测”留到了解读环节，检测是全面的，但解读是有选择的。
tNGS则是将“预测”前置到了设计环节，通过对某个系统感染的常见和相对罕见病原的预测，利用“引物或探针”打靶提升NGS病原检测的特异性和敏感性，避免了在该系统定植微生物或不导致该系统感染的微生物的干扰。
所以，我们一开始做tNGS产品定位时，称其为“更接近临床微生物感染真相”的高通量测序产品。
这样的产品其实挺考验设计者对不同微生物生物特性的理解，以及对人体各系统感染不同特点的认知和理解。
我举一个印象很深刻的例子：
既往在mNGS的临床实践中，我们常在肺炎患者的BALF或者痰液样本里检出肠球菌。但实际上，迄今为止我们在文献中尚未有任何符合科赫法则的证据证明肠球菌肺炎。
在设计tNGS呼吸道panel的病原范围时，我和研发就是否纳入肠球菌曾激烈争论。
我的观点多少带着医生背景的“偏执”：
抗生素耐药和不合理使用迄今仍是全球公共卫生的困局和负担，因此作为一个试图“更接近特定部位感染病原真相”的产品，我们要解决的是相对常见的、覆盖绝大多数感染病原诊断。
在这个前提下，如果在呼吸道panel中纳入肠球菌，会不会造成临床误解，甚至增加临床针对耐药G+抗生素不合理使用呢？
同理，在适用咽拭子样本的上呼吸道的panel中，纳入结核分枝杆菌复合群是否必要？
如果咽拭子样本检出结核，是否真阳性？
同样，如果咽拭子样本检出念珠菌是否有临床意义呢？我们每个人的口咽部都存在念珠菌定植啊！
所以，我一直在各种场合建议tNGS不应该是“小宏基因”，tNGS不应该“一个panel适用全样本类型”的原因也在于此。
很高兴看到，今天发布的tNGS检验专家共识也是认同该观点的。
02
探针捕获是mNGS 2.0吗？
首先恳请友商不要揍我，这纯属科学技术探讨哈！
这次发布的专家共识将探针捕获NGS定义为tNGS中的一种。
同时也充分肯定了探针捕获NGS较多重PCR引物扩增子NGS具有更好的兼容性，覆盖基因组范围更大、更广谱。
这也是为何在探针捕获NGS诞生之初有被定义为“mNGS2.0”的很重要原因。
如果是百万级别探针捕获，且病原设计充分考虑到种、属、保守序列以及SNP覆盖，甚至有些基因组小的RNA病毒全基因组覆盖，加上磁珠的非特异性捕获，的确也是可以说其覆盖范围可以等同mNGS的。
但就像我前面说到的，tNGS区别于mNGS的核心是把“预测”前置到设计环节。
即使是百万探针，其性能也不是均一的。
其捕获性能较好的，或者说发挥了捕获正向富集作用的，仍然是探针打靶重点覆盖的、既往mNGS数据积累的、在临床样本检出过的那几千种微生物。
这，已经是一种预测。
因此，从这个角度而言，定义为tNGS也是合理的。
03
多重扩增 or 探针捕获？
这个问题的答案在不同临床场景下是不一样的。
过去3年，多重PCR引物扩增子tNGS是率先起步的，因此其发展也更为成熟。
以应用最广的上呼吸道和下呼吸道panel为例，诞生至今可以说经历过无数次临床感染和微生物专家鞭打和教育。
所以，扩增子tNGS不管是病原范围、引物设计还是生信分析都相对成熟。
目前常见的呼吸道tNGS的标配就是可同时检测RNA病毒和DNA病毒，并且panel覆盖上既包括了导致呼吸道感染的常见病原，也纳入了免疫缺陷患者呼吸道感染可见的真菌、NTM和部分胞内病原。
在我看来，98%的临床呼吸道感染的病原诊断使用多重扩增tNGS已经可以满足临床需要。
在呼吸道之外，中枢神经系统、生殖系统、消化道系统感染以及真菌感染也有相应的扩增子tNGS产品，但因为临床应用的量还较少，期待更多研究验证其性能。
而探针捕获tNGS实则在mNGS基础上增加了磁珠捕获，因此其在特定场景中优势相当明显：
比如对cfDNA打靶较扩增子tNGS更友好。
再加上病原覆盖范围更广，所以在解决中枢神经系统和血流感染的场景中，探针捕获tNGS是能解决这两个场景目前病原诊断痛点的产品。
有小样本研究发现，在初步诊断脓毒症的患者外周血样本中，探针捕获tNGS仅1M数据量，其病原检出的敏感性就远远超过了100M数据量的mNGS。
临床上社区获得性脑膜脑炎、不明原因发热、感染性心内膜炎、脓毒血症等都是探针捕获tNGS更合适的应用场景。
“橘生淮南则为橘,生于淮北则为枳”
再好的产品，也得放在正确的临床场景中才能起到“正向”的助益。
这一点不管对于扩增子tNGS还是探针捕获tNGS，都是一样的。
04
mNGS会被tNGS替代吗？
虽然我参与了tNGS对mNGS的“围剿”，但我内心的看法从未改变：
“这种替代一定会在部分临床场景中发生，但绝不是全部”
先举一个“替代”的例子：
在结核分枝杆菌鉴定和耐药基因检测领域多重扩增tNGS是真的完胜mNGS的。
有研究证实其检测TB的敏感性等同于甚至优于Xpert。这可能是因为其引物设计较Xpert覆盖了更全面的基因和SNP范围。
WHO是有明确文件倡导结核耐药基因检测，来指导耐药结核治疗的（这和细菌领域耐药基因型不能完全等同表型极大不同），也推荐了tNGS用于该场景的检测。
究其原因，是mNGS在这个场景中检测结核耐药基因是相对困难的。
一方面因测序深度不足导致无法检出，另一方面可能因为样本中病原载量较低导致测不到。
扩增子tNGS可正向富集病原核酸，且通过引物设计，可极大弥补测序深度不足导致的耐药基因漏检。
尤其结核耐药突变往往是点突变，mNGS要想检出非常困难，而tNGS恰好可以解决这个痛点。
tNGS甚至可以报告突变频率，更精准的帮助临床判断该耐药突变的实际影响。
但是，这样的故事并不是所有临床场景的“模板”。
mNGS的“广覆盖，无差别”对罕见病原尤其是“X病原”的发现，仍有其不可替代的地位。
抛开这些“独占场景”，随着测序成本的降低，在一些“性能相当”的场景下，mNGS也还是可以继续和tNGS一较高下的。
05
多重PCR的POCT会如何？
“tNGS会被多重PCR的POCT产品取代吗？”
这个是我最近被反复问到的问题。
（十八块腹肌的胖鸽乱入：我也问了，嘻嘻）
在我看来这依然不是一个有“统一答案”的问题：
tNGS和多重PCR的POCT都是临床需要的优秀分子诊断产品，他们在互相竞争也互相补位。
多重PCR的POCT操作简便、TAT短、特异性和敏感性俱佳，非常合适门诊和对TAT有较高要求的临检场景。
tNGS覆盖病原范围较多重PCR的POCT广，更合适住院患者感染病原诊断。
当然，现在也出现了不少病原范围40-60种，甚至90多种的多重PCR产品，这些产品也可能在将来代替一部分tNGS。
06
写在最后
我想套用尹教授的一段话作为结尾：
我们所有的争论，其目的都不是分出观点高低。
我们的目标是一致的，都是希望在感染性疾病病原诊断、耐药基因检测和流行病学研究领域的应用上找到最合适的路径，为临床提供更加精准高效的感染性疾病管理策略。
感谢各位专家在共识制定过程中的努力。
此文成稿于离开上海的航班上，是我作为行业参与者的有感而发，也是tNGS专家共识的狗尾续貂。
抛砖引玉，希望感染分子诊断能得到更好发展和应用，造福患者。
欢迎大家的拍砖和指正。
------彩蛋、彩蛋、彩蛋环节------
茉莉飘香最后说“欢迎大家的拍砖和指正”，那我自然看热闹不嫌事大
所以我邀请了我们的老朋友波哥来“拍砖”了一下。
以下为波哥的话：
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