2024年6月3日，布鲁克公司在第72届ASMS会议上推出了革命性的neofleX™ MALDI TOF/TOF空间成像质谱仪。neofleX™配备了布鲁克专利的smartbeam 3D激光器和增强型成像检测器，确保了具有真实的“方形像素点”MALDI成像采集功能，可满足空间生物学研究的所有需求。neofleX™不仅适用于基于MALDI HiPLEX-IHC流程的宽视野、多通道靶向蛋白质成像工作流程，还能结合多模态成像技术，将空间蛋白质组学数据与代谢物小分子、脂质分子、聚糖分子空间信息相结合，还能将多分子维度空间特征与组织形态学相匹配，获取跨技术维度的整合信息。本文针对不同的MALDI成像应用方案对neofleX™空间成像表征性能进行了考察，作为空间生物学技术的补充工具和转化医学解决方案的新角色，neofleX™的卓越性能得到了充分的证实。
将收集到的鼠脑组织和人结直肠癌FFPE组织分别制备成厚度为10μm和5μm的冷冻切片，随后附着到IntelliSlides®导电载玻片上。MALDI HiPLEX IHC流程中所采用的“预染色鼠脑切片”购自于美国Ambergen公司，用于质谱成像方法的条件优化
脂质成像实验：制备鼠脑组织连续切片，利用HTX M3+基质喷涂仪分别喷涂DHB基质和NEDC基质，分别用于正离子模式和负离子模式的MALDI成像数据采集。
N-糖成像实验：制备人结直肠癌组织切片，根据Glycopath公司提供的操作说明，使用N-糖成像试剂盒进行原位酶解。
多肽成像实验：制备人结直肠癌组织切片，采用文献[1]中描述的方法，使用胰蛋白酶进行原位酶解。MALDI HiPLEX-IHC实验：制备人结直肠癌组织切片，根据AmberGen[2]公司提供的操作说明进行抗体染色，表1为两块组织所采用的质量标签及相应的抗体。在UV box经过5min光照后，质量标签会发生解离，利用HTX M3+基质喷涂仪喷涂HCCA基质。之后在IntelliSlides®的右上角施加少量红磷溶液，用于仪器的质量轴校准。
表1：人结直肠癌和鼠脑切片所采用的质量标签及相应的抗体
所有MALDI成像实验均在布鲁克neofleX™上进行，表2为主要的方法参数，所有数据均在正离子反射模式下采集，空间分辨率为20μm，激光频率为 10,000 Hz。为确保稳定的总离子流（TIC），成像实验均开启图像稳定功能。在flexCompass 2025工作站中通过flexControl 和 flexImaging软件设置成像方法和成像序列，由SCiLS™ autopilot自动化流程进行样本定位、红磷外标校正、激光聚焦和检测器增益优化等。在多肽成像或MALDI HiPLEX-IHC实验中，以胰蛋白酶自溶峰或抗体质量标签作为参考质量列表进行质量轴的实时在线校正。MALDI成像采集后，将基质洗去，对组织切片进行H&E染色。使用20倍或40倍放大的数字切片扫描仪获得高分辨率显微镜图像。使用SCiLS™ Lab 2024b软件对MALDI成像数据进行可视化和统计分析，MALDI HiPLEX-IHC数据在SCiLS™ Scope 1.0中查看，Delta m/z图用Origin 2022 SR1绘制。在MALDI成像中，质谱信号的稳定性是获得无偏图像的关键因素，归一化方式可以提高谱图质量，但当信号接近检测极限（LOD）时就会受到很大的局限性。通过超稳定检测器、稳定的激光器和增益控制减弱基质效应，从而实现信号稳定，这是防止图像数据受损的根本性方法。neofleX™的全新图像稳定功能可补偿潜在的衰减效应，与增强型成像检测器相结合，可实现长期稳定的、高可重现性的成像数据采集。在脂质成像实验中，对neofleX™成像数据的稳定性进行了考察，对两个鼠脑切片连续进行了三次采集，最后将六组成像数据导入到一个SCiLS™ Lab文件中，并进行了无监督空间聚类分析。图1和图2分别为鼠脑正离子模式和负离子模式的空间聚类结果。通过比较可以看到，正、负离子模式下三个连续鼠脑切片空间分割图像一致，而且基于MALDI成像的分子图谱可以很好地描绘出鼠脑的精细微观结构。图2B给出了三个连续切片的总离子流图像（TIC），质谱信号在13个小时的连续采集过程中表现出很好的稳定性，没有任何衰减迹象，充分证明了neofleX™成像功能模块的稳定性。在脂质成像实验中，对 neofleX™成像数据的稳定性进行了考察，对两个鼠脑切片连续进行了三次采集，最后将六组成像数据导入到一个 SCiLS™ Lab 文件中，并进行了无监督空间聚类分析。图1 和图2分别为鼠脑正离子模式和负离子模式的空间聚类结果。通过比较可以看到，正、负离子模式下三个连续鼠脑切片空间分割图像一致，而且基于MALDI成像的分子图谱可以很好地描绘出鼠脑的精细微观结构。图 2B给出了三个连续切片的总离子流图像（TIC），质谱信号在13 个小时的连续采集过程中表现出很好的稳定性，没有任何衰减迹象，充分证明了 neofleX ™成像功能模块的稳定性。图1：鼠脑正负离子模式的成像数据的空间聚类分析结果
MALDI HiPLEX-IHC多重靶标蛋白质成像实验
MALDI HiPLEX-IHC是布鲁克在2022年ASMS会议上推出的空间生物学工作流程，基于Ambergen Miralys™的肽标签抗体试剂盒，对组织中的蛋白质表达进行多通道空间分析。neofleX™支持 MALDI HiPLEX-IHC样品的自动数据采集，并生成 OME-TIFF 文件，最终在SCiLS™ Scope 1.0软件中自定义颜色搭配，可快速获得空间蛋白质组学的可视化图像。为了探究neofleX™在MALDI HiPLEX-IHC流程中的性能，首先对采集过程中的质量偏差进行了分析与比较。图3分别为不开启和开启在线校正功能的质量偏差对比，发现在成像过程中开启在线校准功能后，数据的质量稳定性明显提高。在没有在线校准的情况下，测定的质量偏移为300ppm; 而使用在线校准功能后，质量稳定性提高了10倍，达到30ppm。实验最终获得了结直肠癌组织的14个目标蛋白的表达，图4为选中的五种蛋白质的可视化图谱，基于neofleX™的MALDI HiPLEX-IHC流程为临床研究中蛋白质的空间分布探索提供了更快的速度和更宽的视野。图3：MALDI HiPLEX-IHC流程中开启在线校正功能和不开启的质量偏差对比
图4：结直肠癌样本的MALDI HiPLEX-IHC 数据的可视化呈现
基于MALDI成像的N-聚糖可视化分析策略近年来已经成为一种重要空间生物学手段，广泛应用于癌症发病机制研究之中。MALDI成像实验给出了结直肠癌标本的N-糖分子表达图谱，其中超过100个N-聚糖信号与布鲁克的N-聚糖数据库相匹配。图5为其中6种N-糖分子的成像图像，可以明显看到在肿瘤的特定区域具有显著高表达，例如在肿瘤细胞表面呈现高表达的是高甘露糖分子。为了进一步理解疾病过程背后的分子作用机制，将同一组织切片的H&E染色高分辨率显微图像导入SCiLS™ Lab中，并与聚糖图谱进行共定位分析（图6）。发现m/z 2053.815对应的四元N-糖主要分布于结肠癌的粘液瘤区域，而m/z 1688.647对应的平分型 N-乙酰葡萄糖胺则主要存在于上皮隐窝细胞区域，与文献报道结果相一致[3]，而m/z 2122.810和m/z 2448.852的聚糖主要存在于肿瘤基质区域。此外，更复杂的岩藻糖基化 N-糖分子（m/z 2742.983）与典型的B 细胞标记物CD20呈现出“空间共定位”特征。图6：同一个组织的N-聚糖成像和H&E染色共定位分析
[1] Ly A, Longuespée R, Casadonte R, Wandernoth P,
Schwamborn K, Bollwein C, Marsching C, Kriegsmann K, Hopf C, Weichert W,
Kriegsmann J, Schirmacher P, Kriegsmann M, Deininger SO (2019), Proteomics Clin
Appl, 13(1):1800029. https://doi.org/10.1002/prca.201800029.
[2] Lim MJ, Yagnik G, Henkel C, Frost SF, Bien T,
Rothschild KJ (2023), Front Chem, 11:1182404.
https://doi.org/0.3389/fchem.2023.1182404.
[3] Drake RR, Powers TW, Jones EE, Bruner E, Mehta AS,
Angel PM (2017), Adv Cancer Res, 134:85.
https://doi.org/10.1016/bs.acr.2016.11.009.
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