>> 前言 <<
机体衰老是每个人随着年龄增长都不可避免的过程，其中皮肤变化是最明显的衰老迹象之一。细胞衰老后会分泌促炎因子，它会促进慢性炎症发生，推动正常细胞步入衰老进程，因此它们被称作衰老相关的分泌表型（SASP）。近年来，许多研究指出磷脂（PLs）及其氧化形式属于 SASP 因子，在皮肤老化过程中起着至关重要的作用。其中，1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-磷脂酰胆碱（PAPC，图1A）是细胞膜和脂蛋白中常见的脂质，可以作为监测皮肤老化进程的指标。PAPC中的花生四烯酸结构容易发生氧化和碎裂，产生多种氧化产物（oxPAPC，如图1B、图1C所示），它们密切参与了炎症的调节过程，并在皮肤过早衰老中起到一定的作用。掌握PAPC及其氧化产物在皮肤组织中的空间分布信息对于准确揭示皮肤衰老以及其他相关疾病的作用机制具有重要的意义。
MALDI质谱成像是一种分子成像技术，它可以同时获得组织中的几百至上千个分子的空间分布信息。磁共振质谱（MRMS，又称为FTICR MS）是一种超高分辨质谱技术，它能将仅有几个mDa差异的分子区分开。将两种技术相结合，可以精准地找出并识别年轻和衰老皮肤中PAPC和oxPAPC分子，并给出它们特异性的的空间定位信息。
图 1. PAPC(A)和两种氧化产物LysoSPC(B)、LysoPC(C)的化学结构
实验方法
将收集的31岁和63岁女性患者的OCT包埋皮肤活检样本制备成冷冻的组织切片（厚度10μm），附着到ITO导电载玻片上。考虑到样本易碎性，因此不进行OCT清洗，然后在自制的升华装置上喷涂1,5-DAN基质（密度0.26mg/cm2）。通过布鲁克7T scimaX MRMS质谱仪在正离子模式下进行MALDI成像数据采集，空间分辨率为40μm和10μm，质量范围为m/z 107-2000，瞬态约为1s，2-omega模式检测，m/z 400的分辨率为350000。数据分析使用SCiLS™ 2023a Pro进行，以基质峰面积（m/z 317.17607）对原始数据进行归一化处理。脂质鉴定基于精确质量数，使用LipidMaps数据库搜索（质量偏差m/z ±0.005）。
图 2. 基于磁共振质谱的MALDI成像流程
结果与讨论
图3为PACA、LysoSPC和LysoPC三种脂质在年轻皮肤组织和年老皮肤组织的空间成像热图。PCPA（m/z 782.56933，质量偏差为0.13ppm）主要分布在年轻的皮肤组织中，而在年老的皮肤中含量较低，说明它会随着时间的推移被逐渐氧化消耗掉；而其氧化产物LysoSPC (m/z 524.37100，质量偏差为0.13ppm）和LysoPC（m/z 496.33980，质量偏差为0.08ppm）在年老的皮肤组织中明显含量更高，且具有显著的空间分布差异。此外，可以看出LysoPC在皮肤组织、特别是真皮上层细胞中含量较高，可能的原因是LysoPC为PAPC的最终氧化产物。
图 3. 年轻皮肤组织和年老皮肤组织的40µm空间分辨的离子热图对比
磁共振质谱（MRMS）技术具有无与伦比的质量分辨率，它揭示出在PAPC谱峰的附近、仅3.4mDa相差的质量位点存在另一种“隐藏的”分子（m/z 782.56578 ± 1ppm）；图4B显示了该分子的空间分布，与PAPC（图4A）具有显著的差异，进一步佐证了它们为两种不同的生物分子。通过LipidMaps搜库，初步确定了该未知组分可能为磷脂酰胆碱（PC 34:1）或磷脂酰乙醇胺（PE 37:1）的加钠形式；若要进一步鉴定这种成分，需要采集二级谱图、通过产生的脂质头部官能团进行确认。图4C还给出了常规TOF类质谱仪的MALDI成像模拟结果。这类质谱仪的质量分辨率通常为40000-60000，无法有效区分质量相差仅为3.4mDa的两个分子，因此会给出错误的离子成像热图。
图 4. 年轻皮肤组织和年老皮肤组织的40µm空间分辨的离子热图对比
结 论
布鲁克的磁共振质谱仪（MRMS）可用于质量范围m/z 100-1,500的小分子的MALDI成像分析，它在宽质量范围内具有超高的质量分辨率和亚ppm级的质量精度。在本文的示例中，它对仅有mDa质量差异的分子实现了特异性的空间成像分析，深度挖掘出了其它类型质谱仪所不能提供的“隐藏的”分子信息。此外，超高分辨率下还可以提供同位素精细结构（IFS），为分子式的确认提供了重要的信息支撑。
应用文献下载
参考文献
[4] Sud M, Fahy E, Cotter D, Brown A, Dennis E, Glass C, Murphy R, Raetz C, Russell D, Subramaniam S (2006). LMSD: LIPID MAPS® structure database. Nucleic Acids Research, DOI: 10.1093/nar/gkl838.
