3D细胞培养技术（three-dimensional cell culture, TDCC）是指将细胞与具有三维结构材料的载体在体外共培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中生长、迁移，最终形成3D的细胞-载体复合物。该项技术有助于减少动物实验，3D细胞培养技术广泛地应用于制药行业和生命科学行业：该项技术有助于减少动物实验。与传统的2D细胞培养相比，3D细胞培养更贴近于真实的体内环境，具有更强的临床相关性，是更好的药物发现预测工具，并在指导个性化医疗方面显示出巨大的前景。基于MALDI质谱成像的空间代谢组学技术是继代谢组学之后又一门新兴的分子成像技术，与传统组学研究不同，空间代谢组学不仅关注生物体内的分子组成，更重要的是它揭示了这些分子在组织甚至细胞层面的空间分布与动态变化。
3D细胞培养模型尺寸较小（直径约为300-3000μm），但蕴含的分子信息量巨大。空间代谢组学数据分析工作流程通常涉及多个软件的使用，包括供应商软件、开源脚本的使用以及用户自行开发的数据合并方案。不同软件间数据格式不同，它们之间的整合、衔接难度巨大，给数据分析带来了极大的挑战。布鲁克最新将数据处理、分析和分子注释整合到了一个软件—SCiLS™ Lab软件中，在保证数据完整性的同时、简化了分析流程，为用户带来了全新的体验。图1. 3D细胞培养模型的timsTOF fleX空间组学分析流程
基于timsTOF fleX的空间代谢组学数据采集
（1）3D细胞培养模型的构筑
以良性成纤维细胞为核心，周围以恶性结肠癌细胞环绕，形成3D细胞培养球体。任一细胞类型的单一培养球体在此⽤作参考，以确定单一培养物的分子指纹是否可⽤于区分双培养模型中的成纤维细胞和结肠癌细胞。
（2）timsTOF fleX空间组学数据的采集
对3D细胞培养球体进行冷冻切片，HTX-TM3 sprayer喷涂NEDC基质。timsTOF fleX质谱仪用于3D细胞培养模型的MALDI成像数据的采集，参数设置：负离子模式，空间分辨率20μm，质量范围m/z 300-1200，淌度范围1/K0 0.60–1.79Vs/cm2，ramp time 设置为 150ms。
基于布鲁克SCiLS™ Lab 2024b软件的数据分析
3D细胞培养模型的空代数据导入至SCiLS™ Lab软件，基于布鲁克独特的T-ReX3算法，软件会自动从带有离子淌度MALDI成像数据中提取特征分子。其中，T-ReX3非常重要的优势在于：可以智能识别同位素和不同离子的加合峰，自动去同位素、合并同一分子的不同加和峰（与分子注释相结合），并将这些信息统一到同一feature中，最终消除冗余，获得“干净”的feature列表。上述获取到的feature列表可直接通过SCiLS™ Lab软件链接到MetaboScape®软件进行分子信息的标注，其中用于分子注释的数据库列表来自于LipidMaps（www.lipidmaps.org）或者HMDB（www.hmdb.ca），生成包含化合物名称、分子式、InCHI和标识符的代谢组学目标列表，并提供仪器及相关的设定参数。（3）3D细胞培养模型MALDI成像数据的统计分析数据导入至SCiLS™ Lab软件中，对数据进行归一化（Root Mean Square，RMS）处理。使用注释后的分子特征列表对成像后的数据进行空间聚类分析，采用K-means（K=2）方法，来扣除基质背景的干扰，如图2所示。通过空间聚类算法，绿色区域为基质背景，白色区域为感兴趣的样本区域（图 2a）。经过背景扣除，图 2b中显示的即为感兴趣的样本区域，后续可以针对该区域做进一步的统计分析。对图 2b中的目标区域再次进行空间聚类分析，根据分子组成的差异，进一步区分出单一培养和双培养模型中的成纤维细胞、结肠癌细胞（图 3a）。对这四组细胞再进行PCA主成分分析，可以直观地看到这四个组别中细胞代谢行为存在显著的差异（图 3b）。分析结果表明，在双培养模型中存在着细胞亚群，如与癌症相关的成纤维细胞（CAF）。因此，该分析流程适用于CAF代谢行为的研究。本文以3D细胞培养模型作为分析对象，建立了一套基于布鲁克timsTOF fleX质谱仪和SCiLS™ Lab软件的空间代谢组学分析流程。timsTOF fleX质谱仪将TIMS离子淌度分离与MALDI质谱成像技术进行了有机结合，可以实现高空间分辨率下、代谢物分子的高覆盖深度挖掘。所获得的空间组学数据，通过布鲁克的SCiLS™ Lab软件进行自动化的统计分析，可以快速过滤掉背景噪声、找出目标区域，并实现分子信息的一键标注。该流程可实现对3D细胞模型从空代数据采集、到数据的统计分析、再到分子信息标注的完整表征，它必将对3D细胞培养技术的发展及推广起到至关重要的推动作用。
[1] Wang Y, Hummon AB (2021). MS imaging of
multicellular tumor spheroids and organoids as an emerging tool for
personalized medicine and drug discovery. J Biol Chem. 297(4):101139. doi:
10.1016/j.jbc.2021.101139.[2] Keller F, Bruch R, Schneider R,
Meier-Hubberten J, Hafner M, Rudolf R. A (2020). Scaffold-Free 3-D Co-Culture
Mimics the Major Features of the Reverse Warburg Effect In Vitro. Cells.
9(8):1900. doi: 10.3390/cells9081900.[3] Iakab SA, Keller F, Schmidt S, Cordes J,
Zhou Q, Cairns JL, Fischer F, Schneider R, Wolf I, Rudolf R, Hopf C (2022).3D-Mass
Spectrometry Imaging of Micro-scale 3D Cell Culture Models in Cancer Research.
bioRxiv.12.05.519157; doi: https://doi.org/10.1101/2022.12.05.519157
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