IMSC Poster#布鲁克创新方案
VIP-HESI结合timsTOF技术
提高4D-多组学的检测灵敏度，为高分辨质谱开辟了新的应用空间
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前言
类二十烷酸，也称为类花生酸，是人体重要的信号分子，与炎症等病理过程密切相关。通常情况下，类二十烷酸可以在尿液或亲脂性提取物中被检测到。羟基二十四烯酸（HETE）属于二十烷酸的一个亚类，是许多生物活性代谢物的关键前体。由于其化学结构如15(S)-HETE或20-HETE相对不稳定，因此需要优化LC-MS分析方法以实现温和的去溶剂化和电离。本文介绍了布鲁克新型VIP-HESI双离子源有效提高类二十烷酸分析的灵敏度，创新的捕集离子淌度 (TIMS) 技术利用高度可重现的碰撞横截面积 (CCS)，实现代谢物的高置信度注释。
图1. VIP-HESI离子源
真空绝热喷针-可加热电喷雾电离离子源 (VIP-HESI) 已在EVOQ三重四级杆质谱上有着出色表现，这一技术现完美应用在timsTOF和QTOF系列质谱上，将灵敏度提高5~15倍。VIP-HESI双离子源采用高效陶瓷加热器技术及真空绝热设计，对于不稳定化合物分析至关重要；此外，通过“主动排空”功能，可以保持离子源持续清洁，有效应对大批量的样品分析。VIP-HESI结合离子淌度技术提高4D-代谢组学和4D-脂质组学的检测灵敏度，为高分辨质谱开辟了新的应用空间；结合布鲁克TASQ及MetaboScape软件，为客户持续提供易用、稳定的高分辨LC-MS解决方案。
图2. 4D-脂质组学
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实验设计
类二十烷酸标准品使用MeOH/ACN/H2O/0.1% FA (47%/47%/6%) 稀释获得梯度稀释液（0.1-1000ng/mL），随后将不同浓度的标准品添加至稀释的尿液中（1:100）, 样品采用布鲁克Elute UHPLC串联timsTOF Pro 2质谱进行分离与检测。
色谱分离条件
质谱检测条件
4D ESI (-) -MS数据是通过TIMS-MS获得。使用常规ESI和加热的VIP-HESI离子源，在PASEF模式 (DDA-TIMS-MS/MS) 下进行数据采集，降低源气和电压设置，以实现温和的去溶剂化。
数据处理
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实验结果
标准的PASEF方法的Duty Cycle为0.3s（每个100ms采集 1 MS+2 MS/MS）。因此，在总运行时间为6分钟的液相色谱梯度中, 2.5s的液相色谱峰上约包含7-8个MS数据点。图3比较了羟基二十四烯酸分别应用ESI和VIP-HESI源的采集数据。对于标准电喷雾电离，1ng/mL是最低可检测的浓度水平，在使用VIP-HESI源后，羟基二十四烯酸的LOD从1ng/mL提高到0.3ng/mL，其LOD降低了3-4倍。
值得注意的是，即使在如此低浓度的水平下，CCS值偏差均小于2% [Å2]。因此，利用经离子淌度过滤后所产生的更干净的色谱图及MS/MS图谱（图4和图5) ，提高了定向筛选的数据质量。除根据数据库中的CCS值进行比较，也可以根据化学结构预测CCS值，提高非靶向研究中的注释质量。
图3. 羟基二十四烯酸 (HETE) 在ESI源 (左）及VIP-HESI 源 (右）采集数据比较
图4. 20-HETE、15(S)-HETE和12(S)-HETE的PASEF MS/MS图谱
图5. 蛋白酶解肽段的MALDI-2成像热图。(B) 胶原蛋白酶解肽段的MALDI-2质谱图。使用标准PASEF方法获得的HETE淌度图谱
利用MetaboScape软件对尿液中的内源性化合物进行非靶向分析，根据20-HETE的结构信息（InChI Code）预测CCS值及模拟MS/MS图谱。特别是在使用"低质量"数据库时，MetaboScape可提高Feature注释的可信度，简化了审查结果和去除假阳性的过程。为了增加注释完整性，基于HMDB的Target List（>4700个化合物）用于加标尿液数据的注释。
图6. 注释质量的可视化报告
如图6所示，MetaboScape拥有可视化注释质量系统，匹配情况在AQ图标中得到清晰体现。用户可自定义CCS值、m/z、mSigma、MS/MS Score的阈值范围，如果数据位于一个宽（Wide）/窄（Narrow）的范围内，则在相应的列中用一个/两个条形显示。右侧列表显示仅基于元素组成的特征注释（上）和基于元素组成以及与计算出的CCS值和MS/MS谱图（下）的匹配情况，根据AQ符号显示图形可知，利用后者可显著提高的Feature注释的置信度。
图7. 利用in-silico获得的MS/MS谱图注释(左)、将MS/MS与Spectral Library的谱图相匹配 (中)、自动匹配预测的CCS值，由此产生的偏差可以用来区分假阳性。
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结论
- 基于加热的新型VIP-HESI双离子源提高了类二十烷酸的灵敏度；
CCS值引入提高了Feature注释质量；
使用结构信息有助于利用"低质量Target List"进行非靶向分析。
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