智甄元宇宙｜哺乳动物大脑中自上而下的甜味和苦味控制(二)

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脑干中甜味和苦味味觉的遗传定义神经元

在探索脑干中负责甜味与苦味感知的神经元机制时，我们聚焦于Sst-和Calb2-表达神经元，旨在验证这些神经元的味觉响应是否确实源自舌头上特异性激活的苦味和甜味味觉受体细胞（TRCs）。为了这一目的，我们在TRPM5离子通道缺失的动物模型中重复了光纤光度记录实验，因为TRPM5是苦味与甜味信号传导不可或缺的组成部分，而对酸味与咸味则不起作用（Damak等, 2006; Zhang等, 2003）。实验结果显示，在Trpm5基因被敲除的动物体内，Sst神经元对苦味的反应以及Calb2神经元对甜味的反应均完全消失，这证实了我们的假设。

接下来，我们假设位于脑干孤束核（rNST）的Sst和Calb2神经元群体是连接外周味觉感受器与大脑中枢的关键桥梁，负责传递苦味与甜味信息。基于这一假设，我们设计并实施了一项实验，通过向rNST区域精确注射Cre依赖性白喉毒素A病毒（AAV-Flex-DTA，依据Wu等, 2014的研究），实现了这些特定脑干神经元的遗传消融。随后，我们在消融前后对小鼠进行了详尽的行为测试，以评估它们对甜味和苦味刺激的反应变化。这一实验旨在进一步验证我们的假设，即Sst和Calb2神经元在味觉信息传递中的核心作用。

自由活动的实验动物被训练通过中央出水口摄取水分，该出水口随机提供水、苦味、甜味或酸味等不同味觉刺激（Zhang et al., 2003；如图3A所示）。为了确保动物愿意尝试包括厌恶性刺激在内的各种液体，测试前对它们实施了断水处理，具体方法见STAR方法描述。实验结果显示，对照组动物如预期般对苦味和酸味化合物表现出明显的厌恶情绪，而对甜味则展现出强烈的吸引力（图3B、3D及3E）。

然而，当我们在rNST（脑干的孤束核）中通过DTA介导的方式消融Sst神经元后，一个显著的变化发生了：动物不再回避苦味刺激，甚至对极高浓度（如5 mM奎宁[Qui]）的苦味溶液也表现出热衷饮用的行为（Mueller et al., 2005；图3C和3D）。相比之下，它们对其他味觉刺激的反应，包括对酸味的厌恶和对甜味的偏好，则基本保持不变（图3C和3E）。这些发现确凿地证明了Sst神经元群体在介导苦味味觉反应中的不可或缺性。

接下来，我们进一步研究了Calb2表达神经元在rNST中的作用。通过消融这些神经元，我们观察到实验动物对甜味刺激的吸引力显著减弱，无论是在即时的舔食行为测试（图3F）还是在更为复杂的两瓶偏好测试中（图3H），即便使用高浓度的甜味剂（如20 mM乙酰磺胺酸钾[AceK]）也无法恢复其原有的甜味偏好（Zhao et al., 2003）。值得注意的是，这些动物对另一种愉悦性刺激——低盐的偏好，以及对苦味和酸味刺激的厌恶反应均未受影响（图3G）。这一系列结果有力地支持了Calb2神经元群体在调节甜味吸引行为中的关键作用。

图3. 孤束核中甜味和苦味神经元的消融消除了对苦味的厌恶和对甜味的吸引

(A) 味觉偏好测试设计概览：在rNST区域（如图3B–3D所示）进行双侧注射，引入Cre依赖性DTA病毒，随后动物经历60次随机呈现的味觉刺激测试，以评估其味觉偏好

(B) 典型直方图展示了在5秒测试时段内，实验动物对水（灰色）、20 mM柠檬酸（酸味，蓝色）及1 mM奎宁（苦味，红色）的舔舐行为。特别地，奎宁试验的结果已在左图中按序排列，清晰显示其舔舐模式。

(C) 在rNST区域通过DTA介导消融Sst神经元后（与B中相同动物组），代表性直方图显示了对苦味刺激的厌恶反应显著减弱。虚线标记了对照组动物对苦味物质的平均舔舐水平，凸显了消融后的变化。

(D) 对Sst神经元消融前后动物对苦味刺激（1 mM及5 mM奎宁）的舔舐反应进行了量化分析（n = 6只小鼠）。结果显示，即使在高浓度苦味刺激下，Sst消融的动物也未表现出厌恶反应。数据以平均值±标准误表示，配对t检验显示差异极显著（p < 0.0001，对于1 mM和5 mM奎宁）。

(E) 值得注意的是，消融Sst神经元对动物对甜味和酸味的反应无显著影响。对于甜味剂（AceK）和酸味剂（柠檬酸），反应均未发生显著变化（n = 6只动物；平均值±标准误；配对t检验，p > 0.2对于AceK，p > 0.1对于柠檬酸）。

(F) 另一方面，在Calb2神经元消融后，动物对甜味刺激的偏好显著降低（n = 6只小鼠）。无论是低浓度（4 mM AceK）还是高浓度（20 mM AceK）的甜味剂，Calb2消融组动物的偏好均显著下降（红色条）。数据以平均值±标准误表示，配对t检验显示差异极显著（p < 0.001对于4 mM AceK，p < 0.005对于20 mM AceK）。

(G) 然而，Calb2神经元消融对动物对盐（100 mM NaCl）、苦味（1 mM奎宁）及酸味（20 mM柠檬酸）的舔舐反应无显著影响（n = 6只动物；平均值±标准误；配对t检验，p > 0.9对于NaCl，p > 0.6对于奎宁，p > 0.1对于柠檬酸）。

(H) 为进一步验证Calb2神经元在甜味偏好中的作用，我们进行了长期甜味偏好测试，即在24小时内比较动物对水和甜味物质的摄入量。结果显示，在rNST中消融Calb2神经元后，动物的甜味偏好完全消失，即使使用极高浓度的甜味剂亦无例外（红色条）。比例表示测试期间甜味物质与水摄入的体积比。对照组（注射Flex-DTA的野生型动物，n = 4）与Calb2-cre消融组（n = 6）之间的差异通过非配对t检验确认，显示差异显著（p < 0.05对于1.5 mM AceK，p < 0.0001对于20 mM AceK）。

脑干中的Sst和Calb2神经元分别代表甜味和苦味味觉

在探讨脑干中Sst与Calb2神经元如何分别作为甜味与苦味的神经表征时，一个核心假设是：这些神经元的选择性激活，即便在无实际味觉刺激条件下，也应能驱动相应的味觉行为反应。进一步地，在味觉辨识测试中，即便动物仅尝试饮水，这些神经元的激活也应能被识别并转化为“苦味”或“甜味”的感知体验。

为了验证这一假设，我们利用基因靶向技术，在Sst-cre或Calb2-cre转基因小鼠的rNST（脑干的孤束核）区域引入了AAV-Flex-ChR2病毒，以表达光敏感通道蛋白2（ChR2），这一技术基于Boyden等人的研究（2005）。随后，我们设计并实施了一项行为测试，其中ChR2表达的小鼠在头部固定装置中接受饮水测试，同时结合光刺激（Peng et al., 2015；具体方法见STAR方法部分）。测试会话包括单纯的水试验以及结合舔舐动作触发的光刺激试验（图4A）。关键的是，激光快门被巧妙安置，确保动物能够自我控制刺激的发生，即只有持续的舔舐才会激活光刺激。这一设计允许我们观察动物在感受到不同味觉“幻象”时的自然反应：若刺激引发厌恶，动物会立即停止舔舐；反之，若引发愉悦，舔舐行为将得以增强。

实验结果正如预期：Sst神经元的光遗传学激活立即且显著地抑制了小鼠的舔舐行为（图4B和图4C），这表明Sst神经元的激活被识别为“苦味”体验，从而触发了厌恶反应。相反，Calb2神经元的光激活则显著促进了小鼠的舔舐行为（图4D和图4E），揭示了Calb2神经元的激活被大脑解读为“甜味”信号，激发了食欲反应。这些发现强有力地支持了Sst和Calb2神经元在脑干中分别作为苦味和甜味神经基础的角色。

图4. rNST中Sst和Calb2神经元的激活模拟苦味和甜味

(A) 舔舐触发光遗传学刺激策略示意图：通过Cre依赖的AAV-Flex-ChR2病毒转导Sst或Calb2神经元，并将刺激光纤精确放置于脑干rNST区域上方。此设置允许动物的舔舐行为直接触发光刺激。

(B) 代表性直方图展示了在有无光刺激条件下（蓝色为有光刺激，灰色为无光刺激）的舔舐事件。值得注意的是，Sst神经元的激活显著减少了舔舐行为，表明其激活与厌恶反应相关联。

(C) 舔舐反应量化分析显示，Sst神经元激活导致的舔舐抑制效应在统计上高度显著（n = 8只动物，平均值±标准误，配对t检验，p < 0.0001）。

(D) 类似地，Calb2神经元激活的代表性直方图表明，在有光刺激时舔舐行为显著增加（蓝色），而在无光刺激时则保持较低水平（灰色），显示出Calb2神经元激活对舔舐的促进作用。

(E) 量化分析进一步确认了Calb2神经元激活对舔舐的显著增强作用（n = 6只动物，平均值±标准误，配对t检验，p = 0.01）。

(F) 三端口味觉识别任务示意图：动物被训练从中心吸管随机选择味觉刺激，并通过前往特定端口来报告其味道（甜、苦或低盐）。此任务详细方法见STAR方法部分。

(G) 总结图表显示，动物能够准确识别甜味（4 mM AceK）、苦味（1 mM Qui）和低盐（3 mM NaCl）刺激。特别地，动物在甜味刺激与Calb2神经元光遗传学刺激之间表现出交叉泛化现象，表明两者在大脑中被视为相似的体验（n = 5只动物，平均值±标准误，单因素方差分析后Tukey事后检验，p < 0.001对于NaCl与光刺激，p > 0.3对于光刺激与AceK）。

(H) 在苦味识别方面，动物同样在苦味刺激与Sst神经元光遗传学刺激之间展示了交叉泛化，证明Sst神经元的激活与苦味感知紧密相连（n = 5只动物，平均值±标准误，单因素方差分析后Tukey事后检验，p < 0.001对于NaCl与光刺激，p > 0.9对于光刺激与Qui）。

(I) 四端口味觉识别任务示意图：动物需从采样喷口舔舐随机呈现的味觉刺激，并通过选择三个奖励端口之一来报告其味道（甜、苦、咸）。正确回答将获得奖励，错误则受罚（详见STAR方法部分）。

(J) 在此任务中，动物准确识别了甜味、苦味和高盐刺激，但对新的低盐刺激（3 mM NaCl）反应随机。然而，Sst神经元的光遗传学刺激被明确识别为苦味刺激，显示出苦味与Sst神经元激活之间的强烈关联（n = 4只动物，平均值±标准误，单因素方差分析后Tukey事后检验，p < 0.01对于新刺激与光刺激，p = 0.17对于光刺激与Qui）。

随后，我们采用了一种三端口行为测试模式，依据Wang等人的研究（2018），训练动物通过此系统来报告它们所品尝到的味觉刺激物类型。测试流程中，小鼠首先从中心喷口尝试随机呈现的味觉线索，如甜味或苦味化学物质，随后通过选择右侧或左侧端口来明确指示所感知的味道；正确的选择将赢得水作为奖励（见图4F）。这一过程不仅考验了小鼠的味觉识别能力，还要求其在每次尝试中迅速且准确地做出决策。基于一个假设：Calb2与Sst神经元的激活能在大脑中创造出类似于直接通过口腔摄入的甜味与苦味化学物质的内部体验，我们预期光遗传学刺激能够触发与这些味觉相关的学习性反应（Peng et al., 2015; Wang et al., 2018）。

为了验证这一点，我们首先对表达ChR2的Calb2神经元小鼠进行了训练，使它们能够区分三种味觉线索：甜味（通过向左移动来识别）、苦味（向右移动）以及一种含有微量NaCl（3 mM，用以与水奖励区分开，同样选择向右）的溶液。经过系统的训练，这些小鼠成功地以超过90%的准确率报告了测试溶液的身份（见图4G及图例说明）。紧接着，我们进一步探索了直接光遗传学激活Calb2神经元的效果，结果（图4G所示）表明，小鼠稳定且一致地将rNST中Calb2神经元的刺激识别为甜味刺激，这强烈支持了我们的假设。

我们通过光遗传学刺激Sst苦味神经元进行了类似的实验。在此实验中，动物被训练识别苦味（例如，向右走）、甜味（向左走）以及3 mM NaCl（也向左走）。我们的结果（图4H）显示，rNST中表达Sst神经元的光遗传学刺激被一致地识别为苦味刺激。

为了进一步验证动物正确报告不同味觉刺激物身份的能力（以及将Sst神经元的光遗传学激活识别为“苦味”刺激的能力），我们还设计了一个四端口行为测试，该测试包括一个味觉刺激传递端口和三个独立的反应/奖励端口，每个端口对应一种味觉刺激（图4I）。在这个测试中，小鼠会随机接受甜味、苦味和咸味刺激，并在每次试验中通过选择正确的反应端口来报告测试刺激的身份（例如，甜味=前往端口1，咸味=前往端口2，苦味=前往端口3）。经过训练，小鼠学会了以超过80%的准确率成功报告这三种味觉刺激的身份；相比之下，对于新的刺激，它们仅表现出随机反应（图4J）。正如我们所预料的那样，rNST中Sst神经元的光遗传学刺激确实被识别为苦味刺激（图4J，光刺激条件）。

甜味和苦味回路的自上而下调节

在rNST中，Sst和Calb2神经元作为苦味和甜味感觉的关键传导通路的功能验证，为我们提供了一个基础，用以剖析在引发行为反应时，苦味为何以及如何会覆盖甜味刺激。我们的策略是在rNST中的Calb2神经元中引入GCaMP活性报告基因，并确定当动物在甜-苦混合刺激中同时受到苦味刺激时，其对甜味刺激的反应如何变化。图5A所示的记录表明，当在苦味刺激存在的情况下呈现甜味刺激时，Calb2神经元的甜味反应被显著抑制。相反，甜味刺激对rNST中苦味神经元的活动没有影响（图5B）。

图5. rNST中甜味和苦味神经元的反馈调节

(A) Calb2神经元对甜味刺激或甜苦混合刺激的反应。当存在苦味刺激时，甜味刺激诱发的神经元活动受到强烈抑制。绿色轨迹显示了仅甜味刺激（4 mM AceK）的样本记录，黑色轨迹则显示了混合刺激（4 mM AceK加上5 mM Qui）的反应；黑色条表示味觉刺激的时间长度（10秒）。标度，ΔF/F。右侧面板显示了量化结果；n=7只动物；配对t检验，p=0.01。

(B) Sst神经元对苦味刺激或甜苦混合刺激的反应。即使使用极高浓度的甜味刺激，甜味刺激对Sst神经元由苦味刺激诱发的活动也没有显著影响。红色轨迹显示了仅苦味刺激（1 mM Qui）的反应，黑色轨迹则显示了混合刺激（20 mM AceK加上1 mM Qui）的反应。右侧面板显示了反应的量化结果；n=5只动物；配对t检验，p>0.3。

(C) 激活GCbt（基底核尾部）抑制了Calb2神经元的甜味反应。我们在GCbt神经元中转导了AAV-CaMKII-ChR2病毒（Peng等人，2015年），并在GCbt上方放置了刺激光纤（ChR2，红色）。同一批动物在rNST中的Calb2神经元中表达了GCaMP6s。中间面板展示了一个样本记录，说明了甜味诱发的信号被显著抑制。绿色轨迹显示了4 mM AceK刺激下的反应，黑色轨迹则显示了同时给予GCbt刺激和4 mM AceK刺激下的反应（另见图5B）。标度，ΔF/F。右侧面板显示了反应的量化结果；n=7只动物。配对t检验，p=0.001。在(C)至(F)的轨迹下方的黑色条表示味觉和光刺激的时间长度（10秒）。

(D) 激活GCbt增强了Sst神经元对苦味刺激的反应。红色轨迹展示了1 mM Qui刺激下的样本记录，黑色轨迹则展示了相同刺激与GCbt刺激配对时的反应；n=7只动物。配对t检验，p=0.005。另见图5A。

(E) 从苦味皮层神经元到中央杏仁核（CeA）的光遗传学刺激足以抑制Calb2神经元对甜味刺激的反应。我们在GCbt中转导了AAV-CaMKII-ChR2病毒，但将光刺激光纤放置在CeA上方（Wang等人，2018年）。同一批动物在rNST中的Calb2神经元中表达了GCaMP6s。中间面板展示了一个样本记录，说明了甜味诱发的信号被抑制。绿色轨迹显示了4 mM AceK刺激下的反应，黑色轨迹则展示了同时给予CeA光刺激和4 mM AceK刺激下的反应。

(F) 在中央杏仁核（CeA）中激活苦味皮层神经元的投射对Sst神经元对苦味刺激的反应没有影响；请与(D)进行对比。红色轨迹展示了1 mM Qui刺激下的样本反应，黑色轨迹则展示了同时给予CeA中苦味终端刺激和1 mM Qui刺激下的反应；n=8只动物。配对t检验，p>0.5。

在所有实验中，味觉刺激均通过向清醒动物口腔内灌注的方式给予。

我们假设，在rNST（喙侧脑干味觉核）中，苦味刺激对传入甜味信号的抑制可能由皮层到rNST的顶向下调节介导（见图1C和1D），并据此预测，当动物仅接触甜味刺激时，光遗传学激活GCbt（基底核尾部）将导致rNST中甜味诱发的信号受到抑制。先前的研究已表明，光遗传学激活GCbt能够可靠地触发苦味味觉反应（包括适当的口面部动作、在行为辨别试验中识别光遗传学信号为“苦味”、舔舐抑制以及相应的行为厌恶）（Peng等人，2015年；Wang等人，2018年）。因此，我们利用AAV-Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）-ChR2（Peng等人，2015年）在GCbt的兴奋性神经元中表达ChR2，并研究了其光遗传学激活如何调节甜味Calb2神经元的味觉刺激诱发反应。正如所预测的，我们的结果表明，GCbt的刺激通过抑制rNST中甜味神经元的活性，强烈抑制了甜味信号的传播（图5C）。值得注意的是，我们还研究了GCbt对rNST中苦味神经元的影响，并发现了第二个反馈回路：GCbt的刺激显著增强了苦味编码Sst神经元中由苦味诱发的活性（图5D）。因此，当苦味信号到达味觉皮层时，它们会对脑干中的苦味神经元产生正向反馈，从而放大由苦味物质引起的反应，同时对甜味反应神经元产生负向反馈，抑制并最小化甜味诱发的活性。

……未完待续……

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