智甄元宇宙｜哺乳动物大脑中自上而下的甜味和苦味控制(一)

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要点：

• 在脑干中，甜味与苦味由遗传上截然不同的神经元进行表示。

• 脑干中的SST+和CALB2+神经元负责将苦味与甜味的信号传递到大脑皮层。

• 来自苦味皮层的反馈机制会增强苦味的感知，同时抑制进入的甜味信号。

• 通过杏仁核的皮层反馈确保了由苦味引发的行为厌恶反应保持强烈且持久。

摘要：

哺乳动物大脑内，编码固有行为反应的硬编码电路已成为一个显著特征，这些电路在应对外界刺激时展现出高度的一致性。尤为突出的是，甜味与苦味作为两种截然不同的味觉体验，触发了截然相反的预定行为模式：甜味自然而然地激发了食欲，促使生物体寻求并摄取能量丰富的食物；相反，苦味则作为警报信号，促使生物体迅速回避可能含有有毒化学物质的物质。

在此研究背景下，我们成功地识别并详细描述了位于脑干中的特定神经元群体，它们作为信息传递的关键节点，负责将从舌头接收到的甜味与苦味信号准确无误地传递至大脑皮层进行进一步处理。随后，我们深入探索了大脑如何精妙地调节这些内置的硬编码电路，以实现对味觉行为的精细控制。

通过细致的分析，我们揭示了苦味刺激如何通过复杂的神经机制抑制甜味感知的基础，这一过程不仅展示了味觉系统内部的相互制衡，也凸显了大脑皮层与杏仁核等关键脑区在调节味觉行为中的重要作用。它们对脑干传来的味觉信号施加强烈的正负反馈，从而强化或削弱特定的味觉反应。

最终，我们的研究通过实验证明，一旦阻断这种精细的反馈机制，生物体对生态上至关重要的味觉刺激的反应将发生显著变化。这些发现不仅阐明了硬编码电路如何在高级神经系统的调控下展现出高度的灵活性与适应性，还为我们揭开了所有动物生存所必需的行为反应背后的神经科学奥秘。

图形摘要：

关键词：味觉；摄食；皮层；反馈；抑制；压制；甜味；苦味；杏仁核；行为。

甜味与苦味的化学物质最初由舌头及口腔上皮上特化的味觉受体细胞（TRCs）敏锐捕捉。一旦激活，这些TRCs便启动了一连串的信号传递过程，跨越四个神经元站点，最终抵达味觉皮层（Spector and Travers, 2005; Yarmolinsky et al., 2009）。这一旅程始于TRCs与相应神经节神经元的精准对接——甜味TRCs将信号传递给专门的甜味神经元，而苦味TRCs则与苦味神经元相连。随后，这些信号通过特定的神经通路，在脑干孤束核（rNST）内与目标突触建立联系，进而穿越至大脑深处。

在大脑的进一步旅程中，信号被引导至终板旁核（PBN）及丘脑进行中转与整合，最终抵达味觉皮层。在味觉皮层这片复杂的神经网络中，甜味与苦味由各自独特的皮层神经元群体分别进行表征与处理（Chen et al., 2011）。这一过程不仅揭示了味觉系统的高度特异性与精细分工，也体现了大脑在处理感官信息时的复杂性与精妙性。

一个关于固有行为的核心议题在于探讨其调控机制。尽管有证据显示神经网络能通过特定的路径触发刻板且固有的行为模式，但这并不等同于这些行为完全不受调节或缺乏可塑性；相反，它表明这些神经回路所触发的反应是预设的，无需依赖先前的学习或经验积累（Scott, 2005; Yarmolinsky et al., 2009）。在此，我们重点揭示了影响两种最为显著的味觉品质（即苦味与甜味）感知的神经网络回路，是如何受到来自更高级别控制中心的关键性调控作用。这一发现为我们理解味觉响应的灵活性与适应性提供了新的视角。

味觉皮层与杏仁核向脑干发送显著投射

众所周知，苦味受体的进化历程深刻体现了生物体检测并防止摄入有害化学物质的生存需求（Antinucci and Risso, 2017; Dong et al., 2009; Nei et al., 2008）。然而，在诱人的甜味刺激与潜在的苦味物质并存时，大脑是如何确保对后者产生行为上的拒绝反应的呢？如图1A和S1A所示，这一机制引人深思。在味觉感受的初步阶段，即味觉受体细胞和神经节神经元层面，对于甜味与苦味混合物的神经反应并未展现出显著的交互调制现象（Barretto et al., 2015）。

为了深入探究大脑中可能存在的、由苦味触发的对甜味感知的调制机制，我们采用了特定的荧光示踪剂来标记对苦味刺激优先响应的味觉皮质区域（简称GCbt）（Chen et al., 2011; Peng et al., 2015）以及中央杏仁核（CeA）的神经元。随后，我们利用全脑清洗技术和光片荧光显微镜的快速3D成像能力（依托CUBIC技术），对这些标记的神经元进行了详尽的观察与分析（Susaki et al., 2014; Wang et al., 2018）。之所以选择这两个大脑区域作为研究对象，是因为味觉皮层和杏仁核在编码味觉刺激的身份（即“它是什么？”）和效价（即“它是好是坏？”）方面扮演着至关重要的角色（Wang et al., 2018; Bales et al., 2015; Blonde et al., 2015）。

苦味皮质区域和CeA向rNST的顶下投射

(A)  苦味能有效抑制甜味物质对动物的行为吸引力。实验开始前，通过限制食物和水的摄入来激发动物的觅食动机（具体方法见STAR方法）。随后，动物被置于舔舐试验中，它们随机接触并尝试舔舐甜味、苦味或两者的混合物。

本图呈现了动物对单独甜味刺激（4 mM AceK [乙酰磺胺酸钾]）、单独苦味刺激（5 mM Qui [奎宁]）以及甜味与苦味混合物（4 mM AceK + 5 mM Qui）的舔舐反应量化结果。实验中共使用了5只小鼠，图中所示数值为平均值±标准误（SEM）。经过单因素方差分析，并采用Tukey事后检验进行统计分析，结果显示：与单独甜味相比，动物对苦味和甜味混合物的舔舐反应显著减少（p < 0.0001），表明苦味明显抑制了甜味的吸引力；而苦味与甜味混合物的舔舐反应之间则无显著差异（p > 0.2），说明混合物中的苦味成分主导了动物的行为反应。

(B)  为了追踪源自苦味皮质区域（即GCbt）与杏仁核（特别是中央杏仁核，简称CeA）的神经投射路径，我们在GCbt区域注入了AAV-tdTomato顺行病毒示踪剂，同时在CeA区域注入了AAV-EGFP顺行病毒示踪剂。随后，经过全脑清洗处理，我们利用光片荧光显微镜技术进行了详尽的全脑成像分析，以清晰呈现这些区域的投射模式。本实验共涉及3只实验动物。

(C) 展示了GCbt（以红色表示）与CeA（以绿色呈现）向脑干rNST区域（以虚线标示）投射的最大强度z轴堆叠图像。图中比例尺为1毫米。

(D) 图示为堆叠冠状切片的放大细节，清晰展示了GCbt与CeA的特定投射模式。具体而言，GCbt的主要投射目标是对侧rNST（左面板，红色标注），而CeA则主要投射至同侧rNST（中面板，绿色标注）。值得注意的是，无论是GCbt还是CeA的投射，均延伸至rNST的腹侧区域。右面板则通过叠加图像，直观呈现了GCbt与CeA投射的共存状态；图中比例尺为0.5毫米。

苦味对甜味吸引力的抑制以及来自苦味皮质区域和CeA到rNST的投射

(A)  本图呈现了剂量反应曲线，揭示了不同浓度苦味物质（奎宁）在抑制小鼠对150 mM蔗糖吸引力方面的效果。选择150 mM蔗糖作为测试浓度，是基于先前的蔗糖剂量反应研究结果，该浓度能引发小鼠约50%的最大舔舐反应（Zhao et al., 2003）。图中对比了仅提供150 mM蔗糖（绿色）与同时提供150 mM蔗糖混合10 μM、50 μM、100 μM、200 μM及500 μM奎宁时的味觉偏好结果。实验涉及6只小鼠，数据以平均值±标准误（SEM）表示。所有平均舔舐数据已通过S形函数进行拟合，以便于观察变化趋势。右侧纵轴特别标注了与单独提供150 mM蔗糖时相比，混合奎宁后舔舐反应被抑制的百分比，直观展示了苦味物质对甜味吸引力的削弱作用。实验细节参见STAR方法。

(B) 为了明确GCbt（苦味皮质区域）与CeA（中央杏仁核）向rNST（脑干特定区域）的投射路径，我们在GCbt中注入了AAV-tdTomato顺行示踪剂，同时在CeA中注入了AAV-GFP顺行示踪剂。随后，通过连续的冠状切片及共聚焦显微镜成像技术，我们深入分析了这些投射的详细路径。本实验共涉及4只小鼠，确保了结果的可靠性。图中，R与L分别代表右脑半球与左脑半球，以便于区分左右两侧的神经投射。此外，图中还标注了其他相关脑区，如次级体感皮层（S2）、梨状皮层（Piri）以及基底外侧杏仁核（BLA），以便于读者对整体脑区结构的理解。

(C-E) 以下展示的是四只实验动物中其中一只的特定追踪结果。在(C)部分，我们可以看到AAV-tdTomato顺行示踪剂在GCbt（苦味皮质区域）的注射位置，该点位于前囟后0.3毫米处。接着，在(D)部分，AAV-GFP顺行示踪剂在CeA（中央杏仁核）的注射位置被明确标示，其位于前囟后1.2毫米处。随后，(E)部分呈现了rNST（脑干特定区域）中的投射目标区域，以虚线轮廓标示，具体位置在前囟后6.5毫米处。通过逐步放大图像，我们可以清晰地看到高亮显示的目标区域，其中来自GCbt的红色投射与来自CeA的绿色投射各自分明。值得注意的是，GCbt的投射主要集中在对侧rNST（即右侧注射时，投射主要到达左侧rNST），而CeA的投射则主要集中在同侧rNST。此外，GCbt还向其他脑区发送投射，包括内嗅皮层、旁臂核和伏隔核（相关数据未在此展示）；而CeA的投射则延伸至旁臂核、终纹床核和外侧下丘脑（相关数据亦未展示）。图中比例尺为200微米。

(F-N) 来自另外3只动物的等效结果。

我们的实验结果（如上图所示）清晰地揭示了GCbt（即脑干孤束核的味觉部分）与CeA（中央杏仁核）之间存在显著的神经投射，这些投射精准地延伸至脑干的rNST区域（孤束核的尾部）。这一区域是外周甜味与苦味味觉信号进入大脑的首要门户（Spector和Travers，2005；Hayama和Ogawa，2001；Whitehead等，2000）。这些延伸至脑干的远程神经连接，不仅加深了我们对味觉信号传导路径的理解，更强烈地暗示了一种自上而下的味觉行为调控机制，即大脑高级区域可能通过影响这些投射来直接调控个体的味觉反应与行为。

rNST中的甜味和苦味神经元

为了精确定位rNST（孤束核尾部）内负责处理甜味与苦味信息的神经元，我们采用了携带Synapsin1::GCaMP6s构建体的AAV病毒来感染rNST神经元，从而在这些细胞中表达活动报告蛋白（Chen et al., 2013; McLean et al., 2014; Schoch et al., 1996）。随后，利用光纤光度测定技术（Gunaydin et al., 2014），我们记录了这些神经元对不同味觉刺激的反应。为确保味觉刺激能准确送达舌头，我们特别采用了口腔内插管刺激输送系统（Phillips和Norgren, 1970）。实验结果显示，rNST内存在对五种基本味觉品质均有强烈响应的神经元，符合预期。

为了进一步细分这些神经元，我们参考了Allen小鼠脑图谱。通过向候选Cre驱动基因系小鼠的rNST注射携带Cre依赖性GCaMP6s活动报告蛋白的AAV，我们发现生长抑素阳性神经元（Sst神经元，由Taniguchi et al., 2011; Thek et al., 2019研究确认）对苦味刺激有反应，而钙结合蛋白2阳性神经元（Calb2神经元，同样由Taniguchi et al., 2011研究识别）则专门对甜味刺激作出响应。值得注意的是，Sst神经元与Calb2神经元在rNST内互不重叠，且它们以交织而非地形组织的方式分布。这表明，尽管神经元标记线可能与地形无关，但负责不同味觉信息的神经元仍然可以在特定脑区内展现出明显的功能分隔，正如味觉皮层中甜味与苦味神经元的分布模式所示（Chen et al., 2011），或者像rNST这样相互交织而不影响其对特定味觉刺激的调谐特性。

rNST中味觉神经元的特性

(A) 图示展示了在rNST（孤束核尾部）中，利用光纤光度测定技术记录味觉刺激诱发神经元活动的实验设置。通过病毒载体靶向技术，我们将突触蛋白（syn）启动子驱动的GCaMP6s活动报告蛋白（AAV-Syn-GCaMP6s）成功导入rNST的神经元内。随后，在清醒且头部固定的实验动物上，利用口腔内插管系统给予不同类型的味觉刺激，以监测并记录rNST神经元的实时活动变化。

(B) 图中展示了四只实验动物（详细数据见补充图S2A）对六种不同味觉刺激的平均响应曲线（黑色轨迹），包括水（作为基线对照）、20 mM AceK（甜味剂）、5 mM Qui（苦味剂）、50 mM CA（柠檬酸，代表酸味）、60 mM NaCl（代表咸味），以及50 mM MPG（单钾谷氨酸）与1 mM IMP（肌苷5'-单磷酸）的混合物（模拟鲜味）。灰色区域表示标准误（SEM）。值得注意的是，在每次味觉刺激之前和之后，都持续提供了水流，以确保实验条件的稳定性和数据的可比性。

(C) 研究发现，Sst神经元对苦味刺激具有显著反应。在实验中，我们利用AAV-Flex-GCaMP6s病毒在rNST（孤束核尾部）的Sst-cre神经元中特异性地表达了GCaMP报告蛋白，以监测这些神经元对味觉刺激的活动变化。右侧图表展示了不同味觉刺激下神经元活动的量化结果，其中水作为基线对照。通过计算曲线下面积（AUC）来评估响应强度，数据显示自七只实验动物。平均值±标准误（SEM）表示方法用于展示统计结果。值得注意的是，尽管Sst神经元对甜味刺激也表现出微弱响应，但这可能源于实验动物在套管刺激范式中对甜味溶液产生的强烈舔舐行为，因为在水剥夺条件下，动物即使面对水或干舔刺激也会展现出类似的神经活动。此外，Sst神经元对酸味刺激的小幅响应可能与酸味激活苦味T2Rs受体有关（Barretto et al., 2015; Zhang et al., 2019），这一机制可能通过抑制苦味信号来间接影响酸味响应的幅度。

(D) 研究进一步揭示了Calb2神经元对甜味刺激的特异性反应。在实验中，我们成功地在rNST（孤束核尾部）的Calb2-cre神经元中通过AAV-Flex-GCaMP6s病毒表达了GCaMP报告蛋白，以实时监测这些神经元对不同味觉刺激的反应。右侧图表展示了量化后的神经元活动响应，其中水刺激作为基线对照。实验数据来自六只实验动物，结果以平均值±标准误（SEM）的形式呈现。值得注意的是，Calb2神经元对甜味刺激表现出显著的响应，而对其他味觉刺激则反应较弱或无明显反应。

在(C)和(D)部分所描述的实验中，我们采用了以下味觉刺激物：甜味刺激包括20 mM AceK和600 mM蔗糖；苦味刺激则使用了5 mM奎宁和0.2 mM环己酰亚胺（Cyx）；酸味刺激为60 mM柠檬酸（CA）；咸味刺激采用60 mM氯化钠（NaCl）；而鲜味刺激则是由50 mM肌苷酸二钠（MPG）与1 mM肌苷-5'-单磷酸（IMP）组合而成。图中，阴影和空白条分别代表了味觉刺激持续的时间段，均为10秒。比例尺表示的是荧光信号的变化量（ΔF/F），用于量化神经元活动的强度。

野生型和味觉突变体rNST神经元的响应

(A) 图示呈现了rNST（孤束核尾部）神经元中，通过AAV-syn-GCaMP6病毒表达GCaMP报告基因的动物对多种味觉刺激的响应量化结果。所使用的味觉刺激物包括：20 mM AceK作为甜味刺激；5 mM 奎宁（Qui）作为苦味刺激；50 mM 柠檬酸（CA）作为酸味刺激；60 mM 氯化钠（NaCl）作为咸味刺激；以及由50 mM 肌苷酸二钠（MPG）与1 mM 肌苷-5'-单磷酸（IMP）组成的混合物作为鲜味刺激。实验数据来源于四只实验动物，展示了神经元活动对不同味觉刺激的特异性响应。

(B) 在干舔试验中，我们观察到Sst神经元不仅对水和甜味刺激产生了微弱的响应。为了诱导动物的舔舐行为，实验前对它们进行了36小时的水分剥夺处理。图示展示了在rNST（孤束核尾部）中，Sst神经元对一系列快速呈现（0.5秒）的刺激物——包括10 mM AceK（甜味剂）、100 μM Cyx（环己酰亚胺，苦味剂）、纯水以及模拟干舔的喷口刺激——的光纤光度测定记录。通过计算曲线下面积（AUC）来量化神经元的响应强度，数据来源于五只实验动物，并以平均值±标准误（SEM）的形式呈现。这些结果揭示了Sst神经元在特定条件下对多种刺激的敏感性。

(C) 研究发现，Calb2神经元在舔舐行为中并未被显著激活。为了诱导动物的舔舐动作，实验前对它们实施了36小时的水分剥夺。图示为rNST（孤束核尾部）中Calb2神经元对快速呈现（0.5秒）的水或20 mM AceK（甜味剂）刺激的光纤光度测定记录。通过计算曲线下面积（AUC）来量化神经元的响应程度，数据来源于五只实验动物，并以平均值±标准误（SEM）的形式展示。此外，值得注意的是，Calb2神经元对鲜味刺激也未表现出显著的激活反应，尽管鲜味通常被认为是一种能强烈引发食欲的吸引力刺激（Zhao等人，2003）。这一发现进一步揭示了Calb2神经元在味觉处理中的特异性角色。

(D) 本图对比了野生型对照（黑色轨迹）与Trpm5基因敲除动物（红色轨迹）的Sst神经元对苦味（5 mM 奎宁）和酸味（50 mM 柠檬酸）味觉刺激的反应。值得注意的是，在Trpm5敲除动物中，对苦味的响应几乎被完全消除，这表明Trpm5在苦味感知中扮演着关键角色。而对酸刺激产生的微弱活性，则可能源于酸味激活了苦味相关的G蛋白偶联受体（GPCRs）（Barretto等人，2015），但这一活性在缺乏Trpm5介导的苦味味蕾细胞（TRC）信号时预期会显著降低（通过比较野生型对照与Trpm5敲除动物对酸刺激的响应可以看出）。相比之下，酸味TRC的特异性响应并未受到Trpm5突变的影响（Zhang等人，2003，详见后文F部分）。实验数据包括野生型对照组7只动物和Trpm5敲除组4只动物的平均值±标准误（SEM）。统计分析采用未配对t检验，结果显示对于奎宁（Qui）刺激，野生型与Trpm5敲除组之间存在极显著差异（p < 0.001）；对于柠檬酸（CA）刺激，两组间也存在显著差异（p < 0.05）。

(E) 本图展示了在野生型对照动物与Trpm5基因敲除动物中，Calb2神经元对不同味觉刺激的响应差异。特别值得注意的是，Trpm5敲除动物对甜味刺激（20 mM AceK）的响应被显著削弱甚至消除，这表明Trpm5在甜味感知的Calb2神经元通路中起着重要作用。实验数据包括野生型对照组6只动物和Trpm5敲除组4只动物的平均值±标准误（SEM）。通过未配对t检验进行统计分析，结果显示对于AceK（甜味剂）刺激，野生型与Trpm5敲除组之间存在显著差异（p < 0.01），而对于柠檬酸（CA，酸味剂）刺激，两组间的差异则不显著（p > 0.4）。

(F) 本研究探讨了rNST（孤束核尾部）中表达Pdyn（前强啡肽）的神经元对酸味和苦味刺激的特异性响应，这一发现与先前的研究（Zhang等人，2019）相一致。结果显示，Pdyn神经元对酸味刺激（50 mM 柠檬酸）具有选择性调整，而对苦味刺激（5 mM 奎宁）则反应较弱。进一步地，当酸味受体OTOP1被敲除后，Pdyn神经元对酸味的响应被完全消除（Teng等人，2019；Zhang等人，2019），这进一步证实了OTOP1在酸味感知中的关键作用。实验数据包括野生型对照组4只动物和Otop1敲除组4只动物的平均值±标准误（SEM）。通过未配对t检验进行统计分析，结果显示对于柠檬酸（CA）刺激，野生型与Otop1敲除组之间存在显著差异（p = 0.02），而对于奎宁（Qui）刺激，两组间的差异则不显著（p > 0.05）。

组织学研究

(A) 图中展示了冠状切片的示意图，特别突出了rNST（孤束核尾部，在左侧面板中以黄色高亮显示）。右侧面板则详细展示了在两个不同动物体内，记录纤维在rNST区域中表达GCaMP的具体位置——一条位于Sst神经元内，另一条则位于Calb2神经元中。请注意，这些记录纤维（以虚线标示）精确地定位于rNST的上方。比例尺为200微米，以便清晰观察。

(B) 图中左侧面板以黄色高亮展示了冠状切片中的rNST（孤束核尾部）区域。右侧面板则聚焦于一只双侧感染了AAV-Flex-DTA病毒的动物，展示了rNST内mCherry报告基因的选择性表达情况。请注意，虚线轮廓清晰地勾勒出rNST区域中mCherry表达的具体位置，显示了病毒介导的基因表达的高度特异性。比例尺设置为200微米，以便于精确观察。

(C) 本图通过原位杂交技术，利用Sst特异性探针，展示了在DTA（白喉毒素A片段）诱导细胞死亡后，rNST（孤束核尾部，黄色高亮）中Sst神经元的选择性缺失情况。左侧面板为冠状切片的示意图，强调了rNST的位置。右侧面板则对比了野生型对照与两只感染了AAV-Flex-DTA病毒的Sst-cre转基因动物的rNST区域，展示了Sst转录本的原位信号放大图像（伪彩色为红色）。正如预期，在DTA表达后，Sst神经元被有效消除，导致相应的Sst信号显著减少甚至完全丢失。比例尺分别为上侧面板100微米、下侧面板50微米，以便清晰展示实验结果。

(D) 本图通过免疫荧光染色技术，展示了在Calb2-cre转基因动物中，通过双侧靶向注射AAV-Flex-DTA病毒诱导DTA表达后，rNST（孤束核尾部，黄色高亮）内Calb2神经元的选择性丧失情况。左侧面板为冠状切片的示意图，突出了rNST的位置。右侧面板则对比了野生型对照与两只感染了AAV-Flex-DTA病毒的Calb2-cre动物的rNST区域，展示了由抗Calb2抗体特异性标记的Calb2神经元（伪彩色为红色）的放大图像。值得注意的是，在DTA诱导的细胞死亡后，Calb2神经元的免疫荧光信号显著减少甚至完全消失，这表明Calb2神经元被有效清除。比例尺分别设置为上侧面板100微米、下侧面板50微米，以便于详细观察实验结果。

Sst和Calb2在rNST神经元的不同群体中表达

(A) 本图展示了双标记策略的设计示意图。在Sst-flp; Calb2-cre双转基因小鼠（即“双报告基因”小鼠品系）中，其rNST（孤束核尾部）区域被同时感染了两种病毒：一种是Flp依赖性的tdTomato报告基因病毒（AAV-fDIO-tdTomato），另一种则是Cre依赖性的GFP报告基因病毒（AAV-Flex-GFP）。这种双标记策略旨在实现对Sst和Calb2神经元的同时且独立的标记，以便于后续的实验观察和分析。

(B) 通过对1146个神经元（这些神经元来自4只不同动物的样本）进行详尽分析，我们量化了表达Sst（标记为tdTomato）、表达Calb2（标记为GFP）以及同时表达两者的神经元数量。为了确保分析的全面性和代表性，我们在每只动物的rNST（孤束核尾部）区域内，选择了跨越其前后范围的三个代表性切片进行考察。结果显示，在总计1146个神经元中，仅有极少数（7个，占比不足1%）神经元同时被tdTomato和GFP两种报告基因所标记；其中，463个神经元特异性地表达了Sst（tdTomato阳性），而676个神经元则特异性地表达了Calb2（GFP阳性）。这一发现表明，在rNST中，Sst和Calb2神经元在大多数情况下是各自独立的，仅有极少数神经元同时表达这两种标记。

(C-E) 这组图像展示了在rNST（孤束核尾部，以虚线轮廓标示）中，分别位于三个不同冠状平面（C: bregma -6.3mm, D: bregma -6.6mm, E: bregma -6.9mm）的神经元表达情况。其中，表达Sst的神经元被tdTomato荧光标记显示为红色，而表达Calb2的神经元则被GFP荧光标记显示为绿色。右侧面板特别突出了那些同时表达Sst和Calb2基因的神经元，即tdTomato和GFP荧光信号重叠的部分。所有图像均使用相同的比例尺（50 μm），以便于比较和分析不同平面和区域的神经元表达模式。

 GCbt及GCbt至CeA投射激活时Sst和Calb2神经元的响应

这些对照实验旨在探究，在没有甜味或苦味刺激的情况下，GCbt（基底外侧杏仁核）及其向CeA（中央杏仁核）的投射被激活后，Sst和Calb2神经元的活动状态或响应情况。这样的设计有助于我们理解这些神经元在味觉处理中的基础活动水平，以及它们是否会在非味觉刺激条件下受到GCbt及其投射的影响。

(A) 在本实验中，GCbt（基底外侧杏仁核）区域被AAV-CamKII-ChR2病毒成功转导，以表达光敏感通道蛋白ChR2（红色标记），随后在GCbt上方精准放置一根刺激光纤。同时，在同一只动物的rNST（孤束核尾部）中，苦味敏感的Sst神经元被转导表达GCaMP6s，用于实时监测神经元活动。中间面板展示了一个代表性的样本记录，该记录显示了在无外界味觉刺激（仅通过口腔插管给予水）的条件下，通过光刺激ChR2进而激活GCbt所引发的Sst神经元响应。正如预期，GCbt的激活通过某种正反馈机制促进了Sst神经元的活化；图中蓝色轨迹代表GCbt受刺激时的Sst神经元响应，而黑色轨迹则表示无GCbt刺激（仅有水通过且未施加光照）时的基线水平。轨迹图同时展示了平均值（实线）及其标准误范围（阴影区域）。刻度代表荧光变化率（ΔF/F）。右侧面板则是对这一响应的量化统计结果，共涉及6只实验动物。通过配对t检验分析，结果显示GCbt激活与Sst神经元响应之间存在显著差异（p = 0.01），进一步验证了GCbt对Sst神经元的调控作用。

(B) 在本实验中，我们探究了在无甜味刺激条件下，GCbt（基底外侧杏仁核）的激活对Calb2神经元活动的影响。结果显示，GCbt的激活并未对Calb2神经元的响应产生显著影响。中间面板展示了一个代表性的样本记录，其中蓝色轨迹代表GCbt受刺激时Calb2神经元的响应，而黑色轨迹则表示无GCbt刺激（即仅有水通过且未施加光照）时的基线水平。轨迹图清晰地显示了平均值（实线）及其标准误范围（阴影区域）。刻度代表荧光变化率（ΔF/F）。右侧面板则是对这一结果的量化统计，共涉及5只实验动物。通过配对t检验分析，我们得出结论：GCbt的激活与Calb2神经元的响应之间无显著差异（p > 0.8），表明在缺乏甜味刺激的情况下，GCbt对Calb2神经元的调控作用可能并不明显。

(C) 本实验进一步探讨了在没有甜味刺激的情况下，激活CeA（中央杏仁核）中接收来自GCbt（基底外侧杏仁核）的苦味皮质投射对Calb2神经元活动的影响。实验结果显示，这种投射的激活并未对Calb2神经元的响应产生显著影响。中间面板呈现了一个典型的样本记录，其中蓝色轨迹代表在刺激GCbt至CeA投射时Calb2神经元的响应，而黑色轨迹则显示了无此投射刺激（即仅有水通过且未施加光照）时的基线水平。轨迹图通过实线表示平均值，阴影区域则代表标准误范围。刻度标明了荧光变化率（ΔF/F）。右侧面板汇总了实验结果的量化数据，共涉及5只实验动物。经过配对t检验分析，我们得出结论：在没有甜味刺激的条件下，CeA中苦味皮质投射的激活与Calb2神经元的响应之间无统计学显著差异（p > 0.08），表明这种投射对Calb2神经元的直接调控作用可能较为有限。

……未完待续……

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