智甄元宇宙｜哺乳动物大脑中自上而下的甜味和苦味控制(三)

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对甜和苦脑干神经元的抑制性和兴奋性反馈

为了揭示皮层自上而下反馈控制的生理基础，我们对大鼠味觉核（rNST）中的单个苦味和甜味神经元进行了膜片钳记录。我们培育了小鼠，其中tdTomato荧光报告基因靶向Sst或Calb2神经元，并使用脑干切片制备法（Hardaway等人，2019；Petreanu等人，2007；图6A；具体方法见STAR Methods）对rNST中的tdTomato标记细胞进行了记录。重要的是，同一批小鼠还在GCbt中表达了ChR2-黄色荧光蛋白（YFP）结构（因此，它们投射到脑干的神经元既表达ChR2又被YFP标记）。我们的结果表明，rNST中的Sst苦味神经元确实接收来自GCbt的兴奋性输入（图6B-6D和S6A-S6K）。我们对77个Sst神经元进行了记录，其中约35%（28/77）的tdTomato标记神经元在rNST中GCbt投射的光遗传学刺激下被强烈激活（图6E和S6B-S6K）。正如预期的兴奋性输入那样，这些反应被AMPA（α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸）受体拮抗剂DNQX（6,7-二硝基喹喔啉-2,3-二酮）阻断（Honoré等人，1988；图6D和6E）。值得注意的是，这些rNST Sst+神经元中的一部分（7/28）还表现出被TTX（河豚毒素）阻断的抑制性电流（Narahashi等人，1964；图S6G-S6L），这表明它们是通过激活抑制性中间神经元介导的；这些抑制性输入可能有助于维持兴奋/抑制平衡，并防止潜在的失控前馈兴奋（Isaacson和Scanziani，2011）。

图6. Sst和Calb2神经元的自上而下突触兴奋与抑制

(A) 我们将ChR2（一种光敏蛋白）靶向至苦味皮层神经元（GCbt）或中央杏仁核（CeA）神经元，并将一种依赖Cre的tdTomato（AAV-Flex-tdT）报告病毒注入到rNST（背侧尾核壳层）中，以标记表达Sst或Calb2的神经元。图示展示了在rNST切片制备中（右侧显微照片），利用ChR2辅助的膜片钳技术绘制GCbt和CeA投射与甜味和苦味神经元之间突触连接的策略。荧光标记的神经元在全细胞电压钳模式下进行记录；虚线勾勒出了膜片钳的轮廓（另见图S6A）。

(B) 在使用光遗传学方法激活苦味皮层终末的同时，对rNST中表达Sst的神经元进行全细胞膜片钳记录突触后电流的示意图。

(C) 在rNST中，光激活苦味皮层终末的ChR2+触发了Sst表达神经元中的时间锁定兴奋性突触后电流（EPSC）。样本轨迹显示了平均响应±标准误（SEM）；更多轨迹请见图6C。EPSC的单突触性质通过其短潜伏期（<15毫秒）推断得出，并通过它们对河豚毒素（TTX）和4-氨基吡啶（4-AP）的不敏感性（图6F）以及逆行标记实验（图S7）得到验证。

(D) 这些EPSC被AMPA受体阻断剂DNQX完全阻断（红色轨迹）。蓝色条表示光刺激的开始和持续时间。

(E) EPSC反应量化分析。图中显示了在光遗传学刺激苦味皮层终末后，来自6只动物的13个神经元表现出的激活的峰值幅度；所有13个神经元的反应均被DNQX阻断（实心红圈）（另见图S6D和S6E）。数值为平均值±标准误。

(F) 在rNST脑片中，使用光遗传学方法激活CeA终末时，对表达Calb2的神经元进行全细胞膜片钳记录突触后电流的示意图。

(G) 在rNST中，光激活CeA终末的ChR2+触发了表达Calb2的神经元中的时间锁定抑制性突触后电流（IPSC）。

(H) 这些IPSC被GABA受体拮抗剂PTX不可逆地阻断，但不受DNQX的影响。

(I) IPSC反应的量化分析；图中显示的是峰值幅度。共有来自4只动物的11个神经元参与了实验，所有11个神经元都对CeA终末的光遗传学刺激产生了响应。实心黑圈表明，这些IPSC不受AMPA受体阻断剂DNQX的影响（测试的4个神经元均如此）。相反，它们被GABA受体拮抗剂PTX不可逆地阻断（测试的6个神经元均如此，实心红圈）。数值为平均值±标准误。更多轨迹和量化分析请见图S6M–S6P。

图S6. 与图6相关的rNST脑片的生理记录

(A) 脑干切片制备示意图，显示了rNST中样本贴片神经元的位置。贴片细胞用生物素填充，并用链霉亲和素Alexa 647染色（伪彩为白色）。

(B) 在使用光遗传学方法激活GCbt向rNST的投射时，对rNST中表达Sst的神经元进行全细胞膜片钳记录的示意图。

(C) rNST中四个接收GCbt前馈兴奋的Sst神经元的样本记录。图中显示了光遗传学刺激GCbt投射时引发的EPSC（上图）和IPSC（下图）（轨迹显示平均值±标准误）。为了记录EPSC或IPSC，膜电位分别保持在-70 mV或-10 mV。蓝色条表示光刺激的开始和持续时间。

(D) 峰值幅度的直方图和蜂群图；n = 21个神经元。

(E) EPSC反应延迟的量化分析。延迟定义为光遗传学刺激开始与EPSC 10%上升点之间的时间。

(F) 在无TTX（n = 21）和有TTX（n = 7）存在的情况下，EPSC延迟和峰值幅度的汇总图。请注意，无论是否加入4-AP（空心圆表示无4-AP，实心圆表示有4-AP），在TTX存在下，EPSC的延迟和峰值幅度均保持不变，这符合单突触输入的预期。未配对t检验：p = 0.2（延迟）；p = 0.7（峰值幅度）。

(G) rNST中一个Sst神经元的样本记录，该神经元接收来自GCbt的前馈兴奋和抑制（在总共28个神经元中，21个仅表现出兴奋性反应，7个既有兴奋性又有抑制性反应；详见正文）。图中显示了光遗传学刺激rNST中GCbt投射时引发的EPSC（上图）和IPSC（下图）（轨迹显示平均值±标准误）。

(H) EPSC峰值幅度的直方图和蜂群图；n = 7个神经元。

(I) EPSC延迟的量化分析。

(J) 相同7个神经元的IPSC峰值幅度的直方图和蜂群图。

(K) IPSC延迟的量化分析。

(L) TTX处理消除了IPSC电流。图中展示了TTX处理前后IPSC峰值幅度的汇总图；共测试了3个神经元。

(M) 在使用光遗传学方法激活CeA终端时，对rNST中表达Calb2的神经元进行全细胞膜片钳记录的示意图。

(N) rNST中四个Calb2神经元的样本记录（上迹）。所有四个神经元在CeA输入激活后均受到抑制，且IPSC反应被PTX处理阻断（IPSC下方的红色迹线）。

(O) IPSC峰值幅度的直方图和蜂群图，n = 11个神经元。

(P) IPSC延迟的量化分析。

为了直接验证苦味皮层（GCbt）与脑干中Sst神经元之间的自上而下单突触连接，我们使用了一种逆行病毒示踪剂（图S7A）。简单来说，我们向Sst-cre动物的rNST中注射了一组AAV病毒，这些病毒携带Cre依赖性病毒受体（TVA，禽类肿瘤病毒受体A），以限制跨突触病毒示踪剂仅感染Sst+神经元；还携带了病毒包装和转移所需的糖蛋白外壳基因（G），以限制病毒跨突触单突触传递；以及红色荧光报告基因（mKate/mCherry）（Reardon等，2016；Wickersham等，2007a，2007b）。初次感染两周后，我们在rNST中注射了逆行RABV-ΔG-GFP狂犬病毒。我们的结果（图S7B）显示，狂犬病毒报告基因从rNST高效传递到GCbt，证实了皮层中GCbt神经元与rNST中Sst苦味神经元之间的单突触连接。

图S7. 来自Sst和Calb2神经元的逆行追踪，与图6相关

接下来，我们研究了苦味介导的Calb2甜味神经元抑制的基础。我们使用脑干切片进行了类似的记录实验，其中Calb2甜味神经元被tdTomato标记，而GCbt投射则表达ChR2-YFP。令人惊讶的是，我们发现没有大量Calb2神经元接收到来自GCbt的输入（在5只动物的23个细胞中，仅有1个显示出来自GCbt的兴奋性输入；数据未显示）。我们假设GCbt可能通过杏仁核（如图1C和1D所示，包括CeA及其向rNST的投射；Wang等，2018）对rNST中的甜味神经元进行调控。因此，我们构建了CeA中表达ChR2的动物，并对tdTomato标记的Calb2甜味神经元进行了记录（图6F）。我们从多只动物中记录了11个Calb2甜味神经元，结果每个神经元在CeA→rNST投射的光遗传学激活后都表现出强烈的抑制性反应（图6G-6I）。如预期所料，这些反应被GABA受体阻断剂PTX（苦毒素）阻断（Newland和Cull-Candy，1992），但不受DNQX影响，证实了它们的抑制性本质（图6H和6I）。为了验证CeA与rNST中Calb2神经元之间的单突触连接，我们还进行了逆行病毒追踪实验（图S7C）。

最后，为了证明杏仁核诱发的抑制确实在体内起源于GCbt（通过其向CeA的主要投射；Wang等，2018），我们在GCbt表达ChR2的小鼠杏仁核上方植入了刺激光纤，并检测GCbt-CeA投射的ChR2激活是否会抑制Calb2神经元中的甜味诱发活动。正如预期的那样，CeA中GCbt终端的光遗传学激活再次复制了当直接刺激GCbt时观察到的Calb2甜味神经元的强烈抑制（图5E）。不出所料，刺激GCbt向CeA的投射对rNST中Sst苦味神经元的活动没有影响（图5F）。这些结果解释了苦味皮层正反馈和负反馈的细胞和生理基础：GCbt对脑干苦味神经元的直接兴奋性输入增强了传入的苦味信号，同时通过CeA的抑制性输入同时抑制了脑干中传入甜味信号的活动。

抑制自上而下的调制消除了由苦味引发的对甜味的抑制效应

我们研究结果的一个关键预测是，如果CeA到rNST的负反馈确实在体内介导了由苦味引发的对传入甜味信号的抑制，那么阻断自上而下的CeA-rNST反馈应该会消除由苦味引发的对甜味信号的抑制。

首先，我们通过注射AMPA受体拮抗剂NBQX（2,3-二氧代-6-硝基-1,2,3,4-四氢苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺）（Tye等，2011）来药理学地沉默CeA。我们在CeA双侧植入套管，等待两周以恢复，并在双侧注射NBQX前后检测rNST中Calb2神经元的反应（图7A）。事实上，我们的结果（图7B）显示，在苦味刺激存在的情况下，Calb2的甜味反应不再受到抑制。正如预期的那样，在药物冲洗后，甜味的抑制作用完全恢复（图7B）。

接下来，我们检查了CeA抑制对行为的影响。我们使用了一种行为测试，其中动物被置于饮水会话中，会话中随机呈现苦味、甜味或甜苦混合液（图7C）。在药理学沉默之前，小鼠对苦味刺激表现出较少的舔舐，对甜味刺激表现出强烈的舔舐反应，而对甜苦混合液的舔舐则大大减少（图7D）。然而，在沉默后，动物对甜苦混合液的吸引力显著增加（图7D）。重要的是，这种行为变化在药物冲洗后是完全可逆的，而在CeA中注射生理盐水对照组则对任何味觉刺激的反应没有显著影响（图7D）。

图7：抑制性反馈的抑制

(A) 药理学沉默策略示意图。在小鼠的中央杏仁核（CeA）双侧植入套管，用于注射NBQX。使用Cre依赖性GCaMP6s报告基因（AAV-Flex-GCaMP6s）靶向rNST中的Calb2甜味神经元，并将头部固定、处于清醒状态的小鼠在NBQX处理前、处理期间和处理后，通过口腔内刺激给予甜味和甜苦混合刺激。

(B) CeA的药理学沉默抑制了由苦味诱发的对甜味反应的抑制。图中所示为对单独甜味刺激（10 mM AceK，黑色）和甜苦混合刺激（10 mM AceK + 2 mM Qui，红色）在注射前（pre）、注射生理盐水或NBQX后以及药物冲洗后（post）的样本平均反应（实色轨迹）± 标准误（阴影）。左图显示了量化结果；反应被归一化为同一记录会话中的单独甜味反应。n = 7 只小鼠；值为平均值 ± 标准误；采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验，p = 1（生理盐水 vs 处理前），p < 0.0001（NBQX vs 处理前），p < 0.0001（NBQX vs 生理盐水）。对于单独甜味，图中显示的是注射前的反应。

(C) CeA的NBQX沉默消除了对甜苦混合物的行为厌恶。我们在CeA上方双侧植入套管以实现药理学沉默，并测试了小鼠对甜味、苦味和甜苦混合刺激的味道反应。

(D) 代表性直方图展示了小鼠在5秒内对甜味（10 mM AceK，灰色）、苦味（2 mM Qui，黑色）或甜苦混合液（10 mM AceK加2 mM Qui，红色）的舔舐事件。四个面板分别展示了注射前（pre）、注射生理盐水和NBQX后以及药物冲洗后（post）的响应（已排序）。AceK和Qui试验的结果以平均值±标准误表示。右图展示了量化结果；舔舐次数被归一化为每个记录会话中的单独甜味响应。n = 8 只小鼠，值为平均值±标准误；采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验，结果显示生理盐水与处理前无显著差异（p > 0.8），而NBQX处理前与处理后有显著差异（p = 0.0002），且NBQX与生理盐水处理间也有显著差异（p = 0.0004）。值得注意的是，当采用更选择性的光遗传学方法抑制CeA向rNST的投射时（E和F部分将详细讨论），并未观察到CeA经NBQX抑制后苦味刺激引起的轻微舔舐增加（Wang等，2018）。

(E) 光抑制策略示意图。将抑制性视蛋白eNpHR3.0或GtACR1双侧注射到CeA中，并将刺激光纤双侧放置在rNST上方，以沉默rNST中的CeA终端。随后，测试了动物在有光抑制和无光抑制条件下对甜味、苦味和甜苦混合物的舔舐反应。

(F) 沉默CeA至rNST的投射显著抑制了对甜苦混合物的厌恶。图中展示了代表性直方图，说明了在无光刺激（黑色）和有光刺激（橙色）条件下，小鼠对5秒甜苦混合刺激（10 mM AceK + 2 mM Qui）的舔舐事件。舔舐次数被归一化为每次记录会话中的单独甜味响应（无光刺激时）。右图展示了量化结果。n = 9 只小鼠（其中4只注射了eNpHR3.0 [空心圆]，5只注射了GtACR1 [空心方块]）；值为平均值±标准误，配对t检验结果显示：混合刺激与混合刺激+光刺激相比，p < 0.0001；苦味刺激与苦味刺激+光刺激相比，p = 0.06；甜味刺激与甜味刺激+光刺激相比，p > 0.5。请注意，光抑制对单独甜味或苦味刺激的反应没有显著影响。

(G) 作为对照，野生型动物的双侧CeA被注射了AAV-GFP病毒，并在rNST上方双侧放置了刺激光纤。图中展示了对5秒甜苦混合刺激（10 mM AceK + 2 mM Qui）、单独苦味刺激（2 mM Qui）和单独甜味刺激（10 mM AceK）的舔舐事件的量化结果。n = 5 只小鼠；值为平均值±标准误，配对t检验结果显示：混合刺激与混合刺激+光刺激相比，p > 0.9；苦味刺激与苦味刺激+光刺激相比，p = 0.16；甜味刺激与甜味刺激+光刺激相比，p > 0.2。这些结果表明，光刺激对野生型动物的舔舐行为没有显著影响。

为了直接证明CeA至rNST的投射驱动了由苦味引发的对传入甜味信号的抑制，我们进行了光抑制实验。我们使用携带抑制性视蛋白（Guillardia theta阴离子通道视紫红质1 [GtACR1]或增强型卤视紫红质[eNpHR]）的腺相关病毒（AAV）感染了CeA（Govorunova等，2015；Gradinaru等，2010），并将刺激光纤放置在CeA投射至rNST的位置（图7E，CeA → rNST）；我们采用了两种不同的抑制性视蛋白，以最大程度地减少使用单一沉默策略可能产生的潜在干扰（Wiegert等，2017）。我们采用了一种行为测试，其中将头部固定、动机明确的动物（即口渴的动物）训练成能够品尝随机呈现的三种不同刺激：甜味、苦味和甜苦混合物。然后，我们让动物经历一系列试验组成的测试会话，但在部分试验中，我们通过光遗传学手段沉默了CeA至rNST的投射。图7F表明，沉默CeA至rNST的负反馈显著减轻了由苦味引发的对甜苦混合物的抑制，而对单独甜味或苦味刺激的反应没有显著影响。相比之下，对表达对照GFP的CeA→rNST投射进行光刺激则没有影响（图7G）。这些药理学和光遗传学沉默研究验证了自上而下抑制在调节对甜苦混合味觉刺激反应中的关键作用。我们注意到，尽管抑制性视蛋白的不完全效果可能是由于双侧沉默的固有低效性，但它也可能反映了其他由苦味引发的抑制机制，如rNST中的局部抑制性回路（Thek等，2019）。

讨论

硬连接的回路和行为一直是低等生物的一个显著特征，并且通常被认为在哺乳动物大脑中编码简单的动作。相比之下，更复杂的行为则被认为主要是后天习得的。然而，随着发现多方面的行为（Peng等，2015）、代谢（Münzberg等，2016）和生理（Zimmerman等，2017）反应均由硬连接的回路介导，这一观点已经发生了显著变化。

味觉系统作为控制进食选择和摄食行为的主要门户，已成为哺乳动物大脑中多阶段硬连接回路的一个最显著的例子。我们之前的研究表明，味觉通过标记线路触发刻板行为（Lee等，2017；Mueller等，2005；Zhao等，2003），无需事先学习或经验（Peng等，2015）。例如，直接刺激甜味或苦味（GCbt）皮层区域会诱发通常由口服甜味或苦味刺激物引起的完整行为程序。然而，最关键的是，光遗传学激活味觉皮层也能在未体验过甜味或苦味“味道”的动物中引发相同的味觉反应（由于TRCs中一种关键味觉信号成分的遗传缺失；Peng等，2015），这证实了味觉感受的预定性质。

我们在这里表明，甜味和苦味的硬连接神经元可以相互交织，而不影响它们的标记线路特性，从而在形式上将标记线路编码的概念和逻辑与地形学区分开来；即，味觉神经元可以根据其单一味觉编码特性进行分离（Chen等，2011；另见图S7）或相互交织。

我们揭示了皮层如何通过自上而下的控制对硬连接行为进行精细调控（Liang等，2015；Liu等，2016；Xiong等，2015）。我们的研究结果阐明了味觉系统如何利用专门的反馈线路来调节先天行为反应。该回路逻辑简单而优雅：提供定向的、相反的反馈，以增强行为厌恶感并抑制吸引力。重要的是，这两种反馈都作用于脑干，这是信号从外周传入大脑的关键枢纽，为确保哺乳动物味觉系统中的苦味厌恶感提供了一种强有力的解决方案。这与果蝇等昆虫不同，在果蝇中，甜味和苦味信号之间的相互作用发生在更早的阶段，包括在感觉神经元层面（French等，2015；Harris等，2015；Jeong等，2013）或在第二级神经元之前的突触前阶段（Chu等，2014）。

rNST中的苦味信号是否也会局部抑制Calb2甜味神经元？在阻断自上而下负反馈后（图7），甜味信号的抑制显著减弱，这一发现强烈表明，对传入甜味信号的抑制（即，从舌头到rNST的抑制）主要是由CeA负反馈启动的。然而，脑干中的局部抑制网络也有可能被向上传递至皮层的苦味信号所激活。从进化的角度来看，拥有多种机制来确保苦味信号抑制甜味吸引力将是有利的。

除了作为味觉区域外，岛叶皮层还是一个重要的内感受部位，负责将多感官信号与内部状态整合（Saper, 2002）。有趣的是，多项研究表明，通过与强烈正性强化物（如酒精）的关联，可以克服对厌恶味道的行为排斥（Seif等，2013；Siciliano等，2019）。

未来，研究大脑中各个味觉站点如何相互作用以及它们如何相互调节和受到如奖励、营养需求、饥饿、饱腹感、情绪和期望等内部状态信号的影响，从而改变味觉感知和味觉相关行为，将是一项有趣的工作。

……完……

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