TET家族自被发现作为DNA去甲基化酶以来，大量的研究表明其在调节转录、表观基因组以及个体发育中具有重要作用。随着研究的深入，科学家们发现TET不仅能实现主动DNA去甲基化，还具有独特的非酶活功能，例如促进组蛋白 O-GlcNAc糖基化和抑制内源性逆转录病毒等1-3。然而，之前的研究大多采用基因敲除或敲降模型研究TET的功能，这些方法难以准确区分其羟甲基化酶活性与非酶活性。此外，敲除或敲降模型无法排除TET家族成员之间的补偿效应，从而影响对TET功能的精确理解。
近日，同济大学生命科学与技术学院高绍荣院士团队，联合江赐忠课题组和陈嘉瑜课题组在SCIENCE CHINA Life Sciences发表了题为“Loss of Tet hydroxymethylase activity causes mouse embryonic stem cell differentiation bias and developmental defects”的研究论文，该研究利用点突变模型详细阐述了Tet羟甲基化酶活性对小鼠胚胎干细胞多能性及分化潜能的影响。
该研究利用CRISPR‒Cas9技术构建了仅缺失Tet羟甲基化酶活性的点突变小鼠，并分别探讨了Tet1、Tet2和Tet3羟甲基化突变小鼠的发育情况。其中，Tet1突变(Tet1m/m)小鼠相比于先前报道的敲除(KO)小鼠，呈现出独特的发育迟缓模式，并出现一定比例的植入前胚胎致死现象。此外，雌性Tet1m/m小鼠在植入后呈现高致死率，少数存活的纯合小鼠也呈现不育表型。Tet2突变(Tet2m/m)小鼠则和已报道的KO小鼠表型类似，主要表现为造血缺陷。Tet3突变(Tet3m/m)小鼠在围产期死亡，但在突变模型中未观察到KO模型所报道的由于Tet3单倍剂量不足造成的新生儿致死现象。以上Tet点突变和敲除表型的异同，为理解Tet酶活性的在体功能提供了新的参考和重要的动物模型。
利用上述模型，研究团队进一步构建了Tet1m/m、Tet2m/m和Tet3m/m胚胎干细胞(mESC)系，并着重对Tet1和Tet2酶活功能缺失进行了系统探究。研究发现，这些细胞系虽然表面上可维持传统干性基因的表达，但同时也异常地获得了一定的扩展多能性，表现为向原始内胚层PrE 和滋养外胚层 TE的分化倾向。同时，在拟胚体形成实验中，Tet1m/m 和 Tet3m/m mESC表现出向神经外胚层分化的缺陷。值得注意的是，尽管传统观点认为Tet3在胚胎干细胞中呈现低表达模式，但其点突变后引起的胚胎干细胞缺陷与Tet1m/m非常相似。此外，免疫荧光染色、全基因组甲基化及羟甲基化测序等实验证明了Tet3对于调控胚胎干细胞的DNA甲基化水平与Tet1相似。此外，TET3蛋白还与TET1蛋白存在大量共调控位点，由于点突变模型不改变蛋白在基因组的结合，从而避免了二者补偿效应的产生。最后，该研究指出关键区域 DNA 甲基化失调是导致神经外胚层发育缺陷的原因。
图1 Tet点突变小鼠的构建及表型
综上所述，该研究利用点突变模型分别造成TET1-3蛋白的羟甲基化酶活性缺失，同时保留TET其他功能不变，排除了家族成员间的补偿效应，详尽探讨了Tet在小鼠发育和胚胎干细胞干性维持及分化中的功能作用。这项工作不仅完善了我们对TET羟甲基化功能的认识，也为区分不同TET家族成员的功能提供了有价值的参考。
同济大学博士生王梦婷、博士后王莉萍、博士生黄琰歆为该文的共同第一作者，同济大学高绍荣院士、江赐忠教授、陈嘉瑜教授为共同通讯作者。该研究获得科技部、基金委及上海市科委等项目资助。
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