近日，Science China Life Sciences发表综述文章Advancing CRISPR base editing technology through innovative strategies and ideas，文章阐述了CRISPR碱基编辑工具研发过程中的创新理念，归纳出组合思维与逆向思维在碱基编辑（base editors, BE）与引导编辑（prime editors, PE）改良与革新中的作用，进而为未来理想化编辑器开发提供了启示。
CRISPR/Cas基因编辑技术的革新近几年呈井喷式发展。它被广泛应用于疾病动物模型构建、生物育种、疾病诊断筛查、基因治疗、细胞定位、细胞谱系追踪、合成生物学、信息存储等领域，但在各个领域开发出理想化的编辑器仍是后续发展的创新目标。
该文聚焦CRISPR衍生的编辑器BE与PE的发展与创新，首先阐释“替代”、“组合”、“适配”、“调整”等改良思路在BE、PE开发中的应用，然后解读了在CRISPR技术创新中所呈现出来的天才般的逆向思维与跳跃性思维。
该文由华东师范大学李大力教授、王立人博士指导，湖南师范大学范雄伟副教授撰稿完成。李大力团队多年来一直致力于解决基因编辑中效率、纯度、特异性、编辑窗口、脱靶效应、旁观者效应等问题，先后开发出高效碱基编辑器hyBE4max、hyABE，单碱基窗口编辑器ABE9，双碱基编辑器A＆C-BEmax ，高效双碱基编辑器hyA＆C-BEmax，腺嘌呤颠换编辑器AXBE/ACBE以及由腺嘌呤脱氨酶TadA改造而成的高精度胞嘧啶碱基编辑器Td-CBEs。
“技术革新是有其内在逻辑的，CRISPR也是如此，在新基因编辑器的开发上，我们需要聚焦具体技术细节，同时也更要从宏观上把控CRISPR创新规律，总结创新方法，这样才能启发我们不断创新”，李大力说。
文章指出，当下的CRISPR系统是一个工具箱，里面包含gRNA(定位系统)、Cas蛋白（编辑平台）、脱氨酶、逆转录酶、整合酶（工具酶）、辅助蛋白（辅助工具）等多种功能组件（图1）。CRISPR技术革新的最大特征在于各种原件通过排列组合，形成为一个编辑程序。再通过Substitute（替代）、Eliminate（减小）、Combine（合并）、Adapt（适配）、Modify（调整）（SCAMPER创新思维模型）等方法优化编辑性能，同时也开发出新的组件，丰富工具箱的内容（图2）。该文系统阐述了基因编辑器从细胞外到细胞内每一个作用环节中，替代、减小、合并、适配、调整等方法在新编辑器开发与革新中的实际案例。
开发新型基因编辑工具的主要思想是将CRISPR/Cas 平台上的四维工具组件进行组合和排列。如C: X1; Y3; Z4表示将 gRNA (X1) ，Cas12(Y3) ; Tns/Rec (Z4) 三个元件组成的编辑器 CAST。工具箱中的工具类型远不止四种，而且每种类型中的组件数量都在不断增加。注: gRNA: 向导 RNA; crRNA: CRISPR 衍生的 RNA; pegRNA: PE 向导 RNA; ωRNA: omegaRNA; vCas9: Cas9变体; IscB: RNA 引导的核酸内切酶 IscB; IsrB: 缺乏 HNH 核酸酶结构域的 IscB 的同源物; APO/AID: 载脂蛋白B mRNA 编辑酶催化亚基/激活诱导的胞苷脱氨酶;TadA: tRNA 精氨酸腺苷脱氨酶，RT: 逆转录酶，Tns/Rec:转座酶/重组酶，AAG: 烷基腺嘌呤 DNA 糖基化酶，MPG:人N-甲基嘌呤DNA 糖基化酶，UGI: 尿嘧啶糖基化酶抑制剂，UNG: 尿嘧啶N-糖基化酶，ssDBD: 单链DNA结合蛋白结构域 MLH1dn: 显性负性的mutL同系物1，P65: 转录因子 P65; la: RNA结合核酸外切酶保护因子; CAST: CRISPR 相关转座酶(Strecker et al，2019) ; CBE4: 胞嘧啶碱基编辑器4(Koblan et al，2018) ; ABE7.10: 腺嘌呤碱基编辑器7.10(Gaudelli et al，2017) ; hyBE4max: 高效的BE4max (Zhang et al，2020a) ;CGBE: 胞嘧啶-鸟嘌呤碱基编辑器(Kurt et al，2021) ; hyPE2: 高效 PE2(Song et al，2021) ; AXBE: 腺嘌呤-其他碱基编辑器(Chen et al，2024a) ; hyA & C-BEmax: 腺嘌呤和胞嘧啶双碱基编辑器(Zhang et al，2020b)。
图2. CRISPR 的SCAMPER模型创新示意图
CRISPR的诞生以及CRISPR衍生技术的出现均源于逆向思维，通过工具箱中的四维重组可形成各种编辑工具。第一个工具箱以 gRNA 作为定位系统开发而成，工具箱中的每个点代表重组后的不同编辑器名称，如 CBE3、ABE7.10、GBE 等等。第二个工具箱是基于 pegRNA 开发的。开发出的基因编辑工具通过替换、适应、调整和精简不断优化，从而进一步应用于其他领域。
文章提出逆向思维在CRISPR/Cas诞生和发展中发挥了重要作用。生命的现象是宿主细胞组织CRISPR/Cas对噬菌体DNA进行切割，而基因编辑是病毒递送CRISPR/Cas进入宿主细胞对宿主DNA进行切割。而每一次逆向思考均伴随着CRISPR的重大突破。从引入DNA双链断裂（DNA double-strand breaks, DSBs）到避免DSB的反向思考中，科学家开发出了BE和PE；从避免副产物到利用副产物的反向思考中，科学家发明了碱基颠换编辑器CGBE与AXBE；从避免旁观者效应到利用旁观者效应的反向思考中，科学家发明出双碱基编辑器A&C-BEmax , Target ACEmax, PACE与 STEM；从细胞核内编辑到细胞核外编辑的反向思考中，而开发出细胞器编辑器mitoBEs，CyDENT，mitoZFDs，mito-Cas9。现在，我们正处于真实实验研究策略到以人工智能和机器运算为基础的虚拟实验研究策略的反向转型中。
文章提出基因编辑器在排列和组合上不但要做加法而且要做减法，阐述了人们为解决编辑器AAV超载问题开发小型编辑器上所做出的努力，并综述编辑器在体内基因修饰中，以AAV为递送系统的应用现状，最后总结CRISPR/Cas创新带来的启示，以及展望理想化编辑器开发的未来。
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