槲皮素(Quercetin，Que)是从药用植物果实中提取的黄酮类化合物之一，为治疗心肌纤维化的潜在临床候选药物[58]。Wang等[59]在体外和体内研究了Que对异丙肾上腺素诱导的心脏纤维化大鼠模型中miR-135b的调节作用及潜在分子机制。结果发现，Que通过促进miR-135b的表达抑制心脏TGF-β/Smads通路，减轻心肌纤维化。Hu等[60]研究发现，Que能有效抑制房颤模型细胞和大鼠心肌组织中miR-223-3p的表达，同时增强叉头框蛋白O3(forkhead box protein O3，FOXO3)的表达、激活自噬通路，显著抑制心肌纤维化，改善房颤心肌重构。
木犀草素-7-二葡萄糖醛酸苷(Luteolin-7-diglucuronide，L7DG)是一种广泛存在于紫苏、薄荷、丹参等中药中的天然抗氧化剂[61]。研究表明，L7DG在组织病理学和分子水平上能减轻异丙肾上腺素诱导的心肌损伤和纤维化[62]。L7DG的心脏保护作用很可能涉及miRNA介导的与TGF-β信号转导相关的多个基因的表达调控，如降低miR-21，升高miR-30c、miR-133b及miR-29c表达等[62]。这些结果有助于增加对L7DG药理活性的理解，并值得进一步评估L7DG作为一种有前途的心脏保护剂的潜力。
芹菜素(Apigenin，APG)是一种从蒲公英、洋甘菊、芫花等植物中提取的天然类黄酮化合物，可以通过不同机制防治心血管疾病[63]。Wang等[64]采用体外细胞实验发现，用APG处理TGF-β1刺激的CFs后，细胞中miR-155-5p、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原等表达降低。用miR-155-5p抑制剂或模拟物转染CFs后，也分别观察到相似或相反的结果。提示APG能够抑制TGF-β1刺激的CFs分化和ECM产生，其机制可能是通过降低miR-155-5p的表达实现的。其他研究还表明，APG可能通过增加miR-122-5p表达抑制TGF-β1刺激的CFs胶原合成及小鼠心肌纤维化[65,66]。
柚皮素(Naringenin，NAR)是麸炒枳实中的一种二氢黄酮类化合物单体[67]，对心血管系统具有显著的保护作用。据报道，柚皮素通过抑制miR-223-3p的表达，靶向胰岛素样生长因子1型受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)通路以促进心肌梗死后缺血性心肌血管生成，减轻心肌纤维化[68]。Guo等[69]研究发现，柚皮素可抑制心肌缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡及白细胞介素-6、白细胞介素-8、肿瘤坏死因子-α等炎性因子的释放，并证实其机制是通过调节miR-26/GSK-3β/β-catenin信号通路实现的。这些结果提示，柚皮素具有改善重大心血管疾病临床转归的潜力。
3.2.2 皂苷类
人参皂苷Re(Ginsenoside Re，G-Re)是人参的主要药理活性成分。研究表明，G-Re对心血管系统有诸多益处，如抗心律失常、保护心肌细胞等[70]。Sun等[71]通过构建小鼠急性心肌梗死模型和AngⅡ诱导的CFs活化模型来研究G-Re的抗心肌纤维化作用。采用超声、酶联免疫吸附实验、组织病理学染色、transwell实验、免疫荧光、蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR等方法在体内外模型中研究，结果显示，G-Re能促进miR-489的转录、降低髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)的表达和NF-κB p65的磷酸化，抑制胶原沉积和CFs迁移，改善心功能。
黄芪甲苷(Astragaloside，AS)是黄芪的一种皂苷类提取物，具有抗炎抗氧化等作用[72]。体内外实验发现，AS-Ⅳ通过靶向miR-135a-TRPM7-TGF-β/Smads通路减轻异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化[73]；同时还能显著抑制高糖诱导的氧化应激和自噬，并通过miR-34a/Bcl2途径改善心肌细胞损伤[74]。顾静等[75]采用X线辐照CFs并与正常成纤维细胞共培养产生辐射旁效应。数据显示，X线诱导CFs中miR-34c表达升高，并通过负调控旁效应成纤维细胞跨膜受体蛋白1(transmembrane receptor protein 1，Notch1)信号促进其分化，提高其致纤维化能力。AS预处理及miR-34c inhibitor转染能有效逆转这一过程，表明AS通过调控miR-34c/Notch1介导的辐射旁效应抑制CFs转分化和促纤维化。
三七皂苷R1(Notoginsenoside R1，NG-R1)是一种从三七中分离得到的新型皂苷，具有改善心肌缺血再灌注损伤的作用[76]。Wang等[77]通过缺血再灌注实验发现，miR-30c-5p在H9c2细胞损伤和凋亡中起关键作用，并阐明了NG-R1通过上调miR-30c-5p抑制氧化应激从而减轻细胞损伤的机制。Liu等[78]进一步研究发现，NG-R1可上调H9c2细胞中的miR-21来改善氧葡萄糖剥夺诱导的损伤，使心肌细胞活力提高，细胞凋亡率降低。Liu等[79]采用异丙肾上腺素构建心肌纤维化小鼠模型，结果发现NG-R1能升高miR-29c在心脏的表达，从而降低Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及TGF-β水平，以发挥心脏保护作用。
3.2.3 萜类
丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA，TSN)为提取于活血化瘀药丹参的一种二萜类化合物，被广泛运用于治疗心血管疾病。Yan等[80]发现，TSN通过上调miR-618发挥对CFs和大鼠心脏组织的抗纤维化作用。Yang等[81]采用低、中、高剂量TSN治疗心肌梗塞大鼠，发现TSN治疗组TGF-β1、α-SMA和Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达下降，miR-29b表达升高。进一步采用miR-29b抑制剂转染TSN处理的CFs，发现该组Ⅰ、Ⅲ型胶原水平下调[81]。由此认为，TSN可以上调miR-29b的表达，抑制心肌纤维化。Qiao等[82]将50例心肌梗死患者随机分为TSN组和常规治疗组，结果显示TSN组患者血浆中miR-205-3p和TGF-β1表达下调。接着采用细胞实验证实，TSN通过上调miR-205-3p抑制TGF-β1诱导的CFs活化。
青蒿素(Artemisinin，ARS)是一种来源于青蒿的倍半萜类内酯化合物，具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等生物学功能[83]。Han等[84]采用H2O2处理H9c2细胞制备心肌损伤模型，发现ARS能缓解H2O2诱导的心肌缺血再灌注损伤。将该细胞模型进一步分为五组：对照组(无处理)、模型组(H2O2)、ARS组(H2O2+ARS)、ARS+miR-29b-3p抑制剂组(H2O2+ARS+miR-29b-3p inhibitor)、ARS+miR-29b-3p抑制剂+si-HMCN1组(H2O2+ARS+miR-29b-3p inhibitor+si-HMCN1)，结合体内动物实验证明，ARS通过诱导miR-29b-3p表达，抑制HMCN1基因表达从而减少心肌损伤、纤维化和细胞凋亡[84]。
3.2.4 多酚类
白藜芦醇(Resveratrol，RSV)是一种存在于虎杖、决明、桑树中的活性多酚物质，具有抗心律失常、抑制纤维化等作用。Zhang等[85]在RSV存在或不存在的情况下，用TGF-β1处理新生大鼠CFs。发现RSV处理能显著降低TGF-β1诱导的CFs增殖和胶原分泌。同时，RSV还能降低TGF-β1处理的CFs中miR-17表达。研究认为，RSV抑制TGF-β1诱导的CFs增殖和胶原分泌，其机制可能是通过下调miR-17来实现的[85]。Yin等[86]发现，RSV能改善冷暴露处理的大鼠心肌超微结构损伤，减轻心肌胶原蛋白累积。机制研究显示，这可能与RSV抑制心肌组织miR-328升高、减缓小鼠心肌细胞凋亡有关[86]。
紫檀芪(Pterostilbene，PTE)是一种主要存在于檀香紫檀、广西血竭的天然二甲基化白藜芦醇类似物，具有抗氧化和抗炎等多效性药理作用[87]。Kang等[88]通过研究发现，PTE可显著改善果糖喂养大鼠和果糖暴露的H9c2细胞的心肌肥大和纤维化。PTE通过增加miR-15b表达以抑制果糖诱导下p-p53依赖性TGF-β1/Smads信号通路的激活，从而减轻心肌纤维化[88]。
鞣花酸(Ellagic acid，EA)是一种来源丰富的天然多酚类小分子化合物，广泛存在于石榴、覆盆子、板栗等果实中，具有显著的抗氧化、清除自由基和抗凋亡等作用[89]。研究显示，EA能明显上调急性心肌梗塞大鼠心肌组织中的miR-140-3p表达，抑制丝裂原活化蛋白激酶6(mitogen-activated protein kinase kinase 6，MKK6)通路，从而提高大鼠左心室功能，减少纤维化和梗死面积，改善梗死后心室重构[90]。
图2 中药复方及有效成分调控miRNA改善心肌纤维化的研究进展图3 靶向miRNA表现出抗心肌纤维化活性的中药有效成分结构式4 中医药安全性评价
随着研究推进，中医药的安全性问题也得到研究人员的重点关注。一些中药单体如Que、APG、ARS、RSV等已进行了较为完善的安全性评价。Que急性毒性实验表明，其对小鼠的半数致死量明显超过10 g/kg， 表明Que在小鼠体内基本可判定为无毒物质[91]；同时，多项致突变实验结果均为阴性，说明Que不会诱导小鼠骨髓细胞与精子发生基因突变[91]。临床研究也显示，超重或肥胖患者在摄入较低剂量的Que(150 mg/d) 6周后，其肝肾功能、电解质均无异常[92]。因此，Que在低剂量使用时有较好的耐受性和安全性，不良反应发生率低。
一项APG急性毒性、遗传毒性及亚慢性毒性实验研究显示，APG大鼠急性毒性的最大耐受剂量大于8 g/kg BW，属实际无毒[93]。APG对大鼠体重、摄食量、食物利用率、血尿常规及生化等无生物学意义的影响，无遗传毒性，且对脏器功能无明显损害[93]。
大量临床研究表明，ARS及其衍生物在临床应用中可能会导致头晕、头痛、恶心、呕吐、腹泻等可控不良反应[94]。高剂量下，其对实验动物的多个器官和DNA有潜在毒性[93]。目前临床研究暂无ARS类药物严重影响肝肾功能及血生化指标等报道，其毒性主要由长期浓度累积而非短期峰值浓度所致[95]。因此，联合用药或改变给药方式及时间、调整溶剂和制剂类型可减轻或消除这些毒性及不良反应。
RSV的毒性作用与剂量相关。Hebbar等[96]研究发现，以0.3 g/kg干预大鼠28 d未见明显不良反应，但1.0 g/kg和3.0 g/kg剂量下雌雄大鼠均出现脱水、呼吸困难和肾毒性，表现为血清尿素氮和肌酐升高，肾病理改变，甚至贫血。临床研究表明，患者口服RSV剂量不超过0.1 g/d时无明显不良反应，而1.0~1.5 g/d时偶见胃肠道不适等，超过2.5 g/d则可能出现恶心呕吐等严重反应[94]，说明高剂量RSV具有毒性，低剂量使用相对安全。
可见，运用中医药治疗安全性较高，但仍需在了解适应症和禁忌症情况下按剂量、按疗程规范使用，同时寻找有效的减毒增效方法，以期最大限度减少不良反应。
5 MiRNA成为心肌纤维化治疗新靶点
MiRNA可通过多种途径调控成纤维细胞增殖活化、产生ECM蛋白等病理过程，从而影响心肌纤维化的发生发展。因此，通过人工手段靶向miRNA调控，有望成为抗心肌纤维化治疗的新策略。
然而，目前尚存在诸多有待解决的问题。首先，单个miRNA能作用于多个器官的多个靶基因，且同一靶基因受不同miRNA调控。因此，miRNA表达大多不具备组织器官特异性，这导致单纯调控miRNA治疗纤维化可能存在“脱靶”效应等局限性。由此认为，理清相关miRNA参与心肌纤维化的调控网络，是实现靶向治疗的必要条件。其次，借助模拟物增强某些miRNA对靶基因的调控有改善心肌纤维化的作用。但由于miRNA模拟物是与前体miRNA类似的双链复合体，细胞摄取能力有限，且需整合至RNA诱导的沉默复合体中才能发挥生物学活性，因此一旦过度表达则会造成沉默复合体饱和，扰乱内源性miRNA的正常生理功能[97]。再次，心肌纤维化是一个复杂网络的病理过程、影响因素繁多，而miRNA与靶基因的调节方式以及各个miRNA之间的互作关系仍未完全阐释清楚。
靶标垂钓是一种新的科学分析方法，通过筛分蛋白混合物识别与药物活性物质特异性相互作用的靶标蛋白，并以其为诱饵，从复杂中药样品中精准钓取活性成分[98]。分子探针技术在新药靶标的发现和靶蛋白的特异性识别中扮演着重要角色。Liu等[99]通过荧光素异硫氰酸酯成功研发了针对尿激酶型纤溶酶原激活剂的分子探针，并建立了基于尿激酶型纤溶酶原激活剂-尿激酶型纤溶酶原受体结合抑制原理的中药混合物筛分法。该法有效分离出中药大蓟中能竞争性抑制尿激酶型纤溶酶原激活剂与尿激酶型纤溶酶原受体结合的潜在先导化合物。Ismail等[100]则利用青蒿素衍生物构建分子探针，该探针不仅定位于靶标蛋白，还能捕获靶标蛋白进行质谱分析，鉴定出124个青蒿素结合蛋白。后续研究揭示，这些蛋白质与疟原虫生物过程相关，表明青蒿素通过多蛋白协同作用治疗疟疾[100]。可见，利用靶标垂钓技术结合实验验证可以帮助探索新的靶标蛋白与药物活性成分，通过进一步溯源有望准确衔接miRNA和中药的联系，对于精准调控、靶向防治心肌纤维化有重要的启示意义。
6 总结与展望
综上可知，心肌纤维化调控机制复杂。MiRNA在转录后水平作用于多条信号通路，从而促进或抑制心肌纤维化的发展，是心血管疾病极具前景的调控位点。中药复方及有效成分具有多靶点、多途径、多环节的特点，在调控miRNA改善心肌纤维化方面具有独特优势。目前，大量基础研究已经为调控miRNA治疗心肌纤维化提供了足够证据，但研究过程中存在的诸多问题仍然是基础科研走向临床实践的“绊脚石”。(1)如何确保miRNA的给药安全性及提高靶向性，实现精准治疗。(2)如何将miRNA作为疾病早期诊断及病情评估的标志物，同时建立精准简便的临床检测方法。同时，miRNA与中医证型之间的相关性也有待研究。(3)如何扩大大样本量的循证医学证据支持，促进科研成果转化。现有相关药物等研究主要局限于基础科研，极少运用于临床，且复方研究较少，不利于中医药的远期发展。因此，如何克服miRNA的多靶点调控作用，运用中医药安全高效地防治心肌纤维化仍需进一步研究与探索。
