刘艺旋 李笑 | 四逆散通过HIF-1α-VEGF信号通路抑制肝癌血管新生的作用机制研究

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1 材料与方法

1.1 动物

1.2 细胞

1.3 药品与试剂

1.4 仪器

1.5 网络药理学分析

1.6 动物实验验证

1.6.4 免疫组化法检测CD31表达水平

组织切片脱蜡，配置抗原修复液，3%双氧水(H2O2)过氧化物酶灭活。一抗CD31抗体，加入5%牛奶，PBS洗涤，生物素化通用二抗工作液，室温孵育，PBS洗涤，辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育，PBS洗涤，滴加DAB显色液，镜下观察切片染色的程度，苏木素复染，脱水封片。最后显微镜镜检，图像采集分析。

1.6.5 免疫荧光检测

组织切片常规脱蜡和抗原修复，BSA孵育，封闭，P-VEGFR2抗体4 ℃过夜，二抗孵育，复染核，封片，镜检拍照。DAPI染核在紫外激发下为蓝色，P-VEGFR2阳性表达为红光。

1.6.6 Western blot检测肿瘤组织中HIF-1α、VEGF蛋白表达

裂解肿瘤组织，超声结束后3 000 r/min离心5 min，收集上清，取上清液继续12 000 r/min离心15 min，4 ℃收集上清。将BCA工作液、标准品和待测样本加入96孔板，37 ℃，测定各孔吸光度值(D)，绘制标准曲线，计算蛋白质浓度并进行加热变性处理。制备凝胶，电泳实验结束，使用电转印方法使蛋白转膜到PVDF膜上，置于TBST溶液中，加入5%脱脂牛奶，室温封闭，一抗鼠抗VEGF溶液(1:1 000)、兔抗HIF-1α溶液(1:500)和兔抗Tubulin溶液(1:8 000)，4 ℃摇床过夜，洗涤，二抗脱脂牛奶配置的鼠二抗溶液(1:8 000)与兔二抗溶液(1:10 000)，洗涤，PVDF膜显影，定量分析，重复3次。

1.6.7 Real-Time PCR检测肿瘤组织中VEGF mRNA表达的变化

裂解肿瘤组织，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清。加氯仿后，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清。加异丙醇，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清。加75%乙醇，8 000 r/min离心3 min，弃上清，重复1次，溶解沉淀，提取RNA产物，检测RNA浓度，逆转录，设计特异性引物，引物由上海凯基生物工程有限公司合成。2‒ΔΔCt法计算RNA相对表达量。引物序列见表1。

1.6.8 统计学分析

实验结果以均数±标准差(x¯±s)表示，两组间均数比较采用非配对t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，使用SPSS 25.0统计软件对数据进行统计分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2.1 四逆散抑制HCC血管新生的靶点筛选

2.2 GO功能富集分析

在DAVID平台上对88个核心靶点进行GO功能富集分析，结果表明，四逆散抑制HCC血管新生主要涉及宿主-病毒相互作用(host-virus interaction)、脂质代谢(lipid metabolism)、细胞周期(cell cycle)、细胞凋亡(apoptosis)等。分子功能集中在与受体(receptor)结合方面，其细胞组分主要集中在细胞质(cytoplasm)(图2)。

2.3 KEGG富集分析

KEGG富集分析结果显示，四逆散主要通过肿瘤信号通路(pathway in cancer)、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、化学致癌-活性氧(chemical carcinogenesis-reactive oxygen species)等抑制HCC血管新生(图2)。

2.4 动物实验验证

2.4.1 四逆散对裸鼠干预后一般状态的影响

裸鼠成瘤率为100%。HCC模型复制成功后，给予不同药物干预14 d，给药过程中，模型组裸鼠出现非常明显的恶病质，体质量增长较慢，部分裸鼠出现感染症状。依据体质量统计表，与模型组裸鼠相比，索拉非尼组裸鼠体质量增加，但差异不具有统计学意义。四逆散高剂量组和四逆散低剂量组裸鼠体质量都呈现一定的上升趋势，但与模型组裸鼠相比，差异无统计学意义(表2)。

绘制移植瘤体积变化曲线，结果表明，模型组裸鼠移植瘤体积增长速度较快，四逆散组裸鼠移植瘤体积增长速度较缓慢；药物干预第8 d、10 d，与模型组相比，索拉非尼组裸鼠移植瘤体积明显小于模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)；第12 d、14 d索拉非尼组裸鼠移植瘤体积均明显小于模型组裸鼠移植瘤体积，差异具有统计学意义(P<0.001)。四逆散低剂量组移植瘤体积较模型组有减小趋势，但差异无统计学意义。从药物干预第10 d开始，四逆散高剂量组裸鼠移植瘤体积明显小于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。药物干预结束，第14 d处死裸鼠，取出移植瘤称重，结果表明，模型组裸鼠移植瘤体积最大、重量最重。与模型组相比，四逆散高剂量组裸鼠移植瘤体积较小、重量较轻，阳性药物索拉非尼组裸鼠移植瘤体积最小(图3)。

图3 四逆散对HepG2 HCC荷瘤裸鼠移植瘤体积的影响

2.4.3 四逆散对裸鼠HCC组织病理学的影响

采用石蜡切片显微镜镜检观察HCC组织病理学改变情况。结果显示，模型组肿瘤细胞较多，癌巢大，癌巢区部分肿瘤细胞出现典型的细胞异型性，核浆比增大，出现分裂象甚至病理性核分裂象，间质纤维结缔组织明显，毛细血管较明显。与模型组相比，索拉非尼组出现大量红染无结构的坏死区域，间质纤维结缔组织和血管数量减少。四逆散低剂量组与模型组相似，癌巢内肿瘤细胞的细胞异型性明显，间质纤维结缔组织较明显，可观察到毛细血管。与模型组相比，四逆散高剂量组坏死区域增加，部分区域出现炎性浸润(图4)。

2.4.4 四逆散对HepG2 HCC荷瘤裸鼠移植瘤组织中CD31表达的影响

用免疫组织化学法对肿瘤血管内皮细胞上特异性表达的CD31进行染色，CD31在瘤组织血管内皮细胞膜上呈棕色阳性表达。免疫组化结果显示，模型组血管数量最多，与模型组相比，索拉非尼组血管数量明显减少(P<0.001)，四逆散低剂量组与高剂量组血管数量均有不同程度减少，其中高剂量组明显减少，差异具有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示，与模型组相比，索拉非尼组CD31的蛋白质表达明显降低(P<0.01)，四逆散高剂量组CD31的蛋白质表达也明显降低(P<0.05)，四逆散低剂量组有降低趋势，但差异无统计学意义。以上结果表明，四逆散可减少HCC组织中微血管的数量(图5和图6)。

2.4.5 四逆散对HepG2 HCC荷瘤裸鼠移植瘤组织中VEGF表达的影响

采用Western blot检测肿瘤组织中VEGF蛋白的表达情况。结果表明，与模型组相比，索拉非尼组和四逆散低剂量组肿瘤组织中VEGF蛋白表达量无明显变化，但四逆散高剂量组较模型组降低趋势明显(P<0.01)。Real-Time PCR结果表明，给予四逆散药物治疗后肿瘤组织中VEGF mRNA水平明显降低，其中低剂量组有降低趋势，但无统计学差异；四逆散高剂量组与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；索拉非尼组无明显变化。以上结果提示，四逆散可降低HepG2 HCC荷瘤裸鼠移植瘤中VEGF mRNA的含量(图7)。

2.4.6 四逆散对HepG2 HCC荷瘤裸鼠移植瘤组织中HIF-1α蛋白的影响

采用Western blot检测肿瘤组织中HIF-1α蛋白的表达情况。结果显示，与模型组相比，四逆散低剂量组HIF-1α蛋白的表达呈现降低趋势，差异无统计学意义。四逆散高剂量组HIF-1α蛋白的表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。索拉非尼组HIF-1α蛋白的表达无明显改变(图8)。

2.4.7 四逆散对HepG2 HCC荷瘤裸鼠移植瘤组织中P-VEGFR2表达的影响

P-VEGFR2的表达部位主要在血管上，因此在肿瘤组织中散在分布。采用免疫荧光法检测HCC荷瘤裸鼠移植瘤组织中P-VEGFR2的表达情况。结果显示，模型组存在一定程度的VEGFR2磷酸化，索拉非尼组VEGFR2磷酸化水平明显降低，四逆散低剂量组和高剂量组都存在少量的VEGFR2磷酸化，提示四逆散可通过降低VEGFR2磷酸化发挥抗血管新生的作用(图9)。

3 讨论

HCC是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其最典型的生物学特点是血管的高密度及异质化[9]，因此抗血管新生是治疗HCC的关键。目前，很多被批准的晚期HCC一线和二线治疗药物主要针对血管生成，索拉非尼就是其中之一。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，可作用于多种位点，包括VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、血小板源性生长因子受体(platelet-derived growth factor，PDGFR)等参与血管生成的靶点[10,11]。

中医学中，HCC属于“积聚”“积气”等疾病范畴。《医宗必读》有云：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之。”可知，其发病机理多是由于肝郁脾虚、气滞湿阻、血瘀津停等多种有形实邪淤积肝脏，日久化生为癌毒。中医理论认为，肿瘤血管新生为“络道亢变”，而邪气入络，络中气滞为因。《伤寒论·辨少阴病脉证并治》记载：“少阴病，四逆，其人或咳，或悸，或小便不利，或腹中痛，或泄利下重者，四逆散主之”。四逆散是“调和肝脾”的经典代表方，由柴胡、白芍、枳实、炙甘草四味中药组成，可疏肝郁解，调畅气血，主治肝脾气郁证[12]，提示四逆散可能通过调畅气血从而调控血管新生发挥抗HCC作用。

为验证以上假说，本研究首先基于网络药理学进行验证。结果表明，四逆散在抑制HCC血管新生中发挥作用的主要成分是槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇等，筛选后得到四逆散抑制HCC血管新生的靶点共88个，体现了四逆散抑制HCC血管新生多成分、多靶点协同作用的特点。研究发现，槲皮素可以通过抑制VEGF和碱性成纤维细胞生长因子的表达，影响Akt相关信号通路、整合素信号通路等，表现出对血管新生的抑制作用[13]。木犀草素可以通过多种机制抑制血管生成，包括抑制VEGF及相关信号通路、PI3K-Akt信号通路、血管新生分子以及孕激素活性等[14]。β-谷甾醇可能通过抑制VEGF信号通路发挥抗血管新生的作用，从而抑制类风湿滑膜血管生成[15]。

GO富集分析发现，四逆散主要细胞组成集中在细胞质中，而分子功能集中在受体，主要参与了细胞周期、细胞凋亡等应答过程。KEGG通路富集分析结果显示，四逆散主要通过肿瘤信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路等发挥抑制HCC血管新生的作用。HIF-1复合物为缺氧应答的主要调节因子。研究表明，HIF-1通路或与癌症免疫有关，故本研究围绕HIF-1通路展开[16]。研究发现，加味四逆散能显著降低荷瘤小鼠血清中VEGF的浓度和HCC组织中的微血管密度，但四逆散对HCC血管新生的作用及其机制尚不清楚[6]。VEGF是HIF-1α发挥作用的重要靶基因之一，当细胞缺氧时，HIF-1α不仅可以直接促进VEGF转录，还可以增加VEGF mRNA的稳定性，从而促进VEGF的表达[17]。HIF是由功能性α亚基和稳定表达的β亚基组成的异二聚体[18]，可参与HCC细胞增殖、血管生成、侵袭和转移等病理过程[19,20]。作为VEGF表达的主要调节因子，HIF-1α在肿瘤组织中过表达，关系到HCC患者的不良预后。目前，靶向HIF HCC治疗药物的研发取得了重大突破[21]。网络药理学和文献研究提示，四逆散对HCC血管新生的作用可能与HIF-1α-VEGF信号通路有关。

本研究在体实验首先验证了四逆散对HCC血管新生的作用。HepG2是一种人肝母细胞瘤HCC细胞株，作为工具细胞，能够在胸腺缺失的裸鼠上建立HepG2诱导的HCC模型。皮下注射HepG2细胞后裸鼠成瘤率为100%，与文献报道一致[22]。结果显示，四逆散对HCC裸鼠体质量并无明显影响，但可明显抑制HCC瘤重，HE染色结果提示四逆散可在一定能程度上抑制HCC的生长。CD31是血管内皮细胞膜上的标记分子，目前肿瘤研究中识别和量化新生血管的通用方法是用免疫组化染色方法对移植瘤组织中的血管进行CD31染色[23]。结果发现，四逆散能明显增加CD31染色；Western blot结果亦显示，四逆散可减少HCC组织中CD31的表达，提示四逆散可通过抑制HCC组织中的血管新生，从而抑制HCC生长。

VEGF和VEGFR是血管生成中最突出的、研究最充分的调节因子，对HCC的增长和发展至关重要[24]。VEGFR2的磷酸化会导致下游相关蛋白的级联活化反应，最终导致内皮细胞增殖、迁移，以及肿瘤血管新生，从而参与肿瘤的生长和转移[25]。此外，HCC组织中的高血管密度、VEGF含量的增加与HCC的进展和生存率的降低相关[26]。Western blot结果表明，四逆散可降低HepG2细胞诱导的HCC组织中VEGF蛋白的表达。Real-Time PCR结果表明，四逆散可降低HCC组织中VEGF的mRNA水平。因此，四逆散抑制HCC血管新生与VEGF相关。

高水平积累的HIF-1α上调了VEGF等一系列血管生成因子的表达，可维持VEGF mRNA的稳定性，进而参与肿瘤血管新生[27,28]。Western blot结果显示，四逆散可通过HIF-1α介导降低VEGF蛋白的表达，参与抗HCC血管新生。VEGFRs为跨膜酪氨酸激酶受体，在生物体内存在3种类型，分别为VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3。其中，与VEGFR2结合是影响肿瘤血管新生的主要途径。免疫荧光结果显示，四逆散可不同程度降低HCC组织中VEGFR2的磷酸化水平，与索拉非尼结果类似，但效果不如索拉非尼明显。VEGFR2的磷酸化水平降低是否依赖于VEGF的改变尚需进一步研究。

综上所述，经网络药理学分析后，四逆散对抑制HCC血管新生具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，可以确定四逆散方剂成分的客观性，经在体实验明确了四逆散对HepG2诱导的HCC血管新生的作用，首次发现四逆散可抑制HCC血管新生，其机制可能通过抑制HIF-1α-VEGF信号通路，影响血管新生过程。该研究结果明确了四逆散对HCC血管新生的抑制作用，为四逆散治疗HCC提供了更多理论依据。从临床治疗的角度，四逆散的应用不仅有中医经典的支持，同时又增加了实验数据的支撑。但本研究仅局限于在体实验，缺乏体外实验进一步明确四逆散的抑癌作用及其对HIF、VEGF等的影响；同时，四逆散抗HCC血管新生过程中VEGFR2的磷酸化降低是否依赖于VEGF水平的降低尚需进一步阐明。