朱岂凡 苟兰涛 | RNA修饰在发育及相关疾病中的作用

自二十世纪五十年代首次被报道以来[1-4]，迄今在RNA上已发现170多种修饰，且几乎所有种类的RNA均能被修饰[5]。这些化学修饰能够改变单个碱基的固有特征，从而影响RNA代谢调控。针对这些修饰的研究促成了表观转录组学(epitranscriptome)，而表观转录组学现有研究中关注最多的是tRNA、rRNA及mRNA上的修饰。这三类RNA在翻译过程中不可或缺，其修饰也影响RNA“生命周期”中的各个阶段，包括RNA剪接、结构、运输、稳定性及翻译效率。因此，RNA修饰是基因从转录到翻译再到降解过程中至关重要的调控因素。

得益于近年来高通量测序技术的不断发展，一部分RNA修饰(如m6A和m5C)的全转录组图谱，已在不同的组织样本中得以绘制，其中包括稀有的细胞类群如卵母细胞和早期胚胎。不同组织及生理环境下RNA修饰的时空动态变化极大地丰富了领域内对其分子功能及生理作用的理解。在机体发育过程中，细胞命运受到严格调控。为了能对外界信号进行快速响应进而做出自我更新、增殖或分化的命运决定，细胞往往需要在完全重建转录谱之前，就能迅速重置蛋白质表达。高度动态的RNA修饰作为一种能够快速响应信号的调控机制，可能是实现这种快速蛋白质谱变化的重要因素[6]。RNA修饰的调控极其复杂，涉及一系列RNA结合蛋白，即RNA修饰的“编码器(writer)”“擦除器(eraser)”和“读码器(reader)”。这些RNA结合蛋白功能障碍导致的RNA修饰异常与不孕不育[7-13]及各种发育障碍[14-16]相关(表1)，进一步提示RNA修饰动态变化及其调控机制在哺乳动物生理发育和疾病发生中有重要作用。

综上，本文梳理了近年来报道的RNA修饰及相关蛋白在哺乳动物生殖系统和机体发育中的调控功能，重点讨论这些修饰如何调控mRNA代谢从而发挥其生理功能，如影响干细胞的自我更新及细胞命运转换等一系列发育事件，并总结展望了RNA修饰领域有待完善或尚未系统探索的一些问题。RNA修饰及其调控蛋白的偏好RNA底物及分子功能已有多篇综述系统总结，本文将其汇总于表1，在文中不再深入讨论。

1 RNA修饰在哺乳动物精子发生中的调控功能

哺乳动物的精子发生(spermatogenesis)是一个高度特化的细胞分化过程。在睾丸的曲细精管中，不同的生精细胞按照特殊的细胞联系排列，由周缘向腔面依次为精原细胞(spermatogonia)、初级精母细胞(primary spermatocyte)、次级精母细胞(secondary spermatocyte)、单倍体精子细胞(spermatid)和精子。精子发生包含三个基本细胞生物学事件：精原细胞的有丝分裂、精母细胞的减数分裂以及单倍体精子细胞中的精子形成(spermiogenesis)。精原细胞的有丝分裂是其自我更新、增殖及分化的基础，为精子发生的稳定和可持续提供保证；精母细胞的减数分裂中，同源染色体非姐妹染色单体间发生配对、联会和重组交换，继而精确分离产生单倍体精子细胞。因而减数分裂的正常进行是染色体数目稳定性、配子遗传多样性和物种适应性的基本前提；单倍体精子细胞则经历了染色质压缩、组蛋白-鱼精蛋白置换、顶体形成及鞭毛组装等一系列复杂的分子和形态学变化，最终形成具有运动能力和受精潜能的精子，即精子形成。综上所述，精子发生这一生理过程极其复杂且高度时空特异，需要多水平的精细调控来保证其顺利进行，而近年来的一系列研究显示，RNA修饰是其中一种不可或缺的调控机制。

1.1 m6A

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)是mRNA上丰度最高的修饰。m6A的写入主要依赖甲基转移酶样(methyltransferase-like，METTL)蛋白家族[18,19,127]；而其去甲基化则主要由脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity associated protein，FTO)[38,128]以及烷基化修复同系物5(alkylation repair homolog 5，ALKBH5)[129,130]介导。m6A修饰的RNA分子能够被一系列m6A阅读蛋白识别，包括YTH结构域蛋白家族(YTHDF1/2/3、YTHDC1/2)[46,49,51,53,56]、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1/2/3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1/2/3，IGF2BP1/2/3)[59]及核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs)[58]等。这些“读码器”通过对m6A的特异性识别，进而影响RNA剪接、核质转运、稳定性以及翻译等关键生物学过程。

2017年，两个研究组利用基于免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)的m6A测序检测方法，分别绘制了精子发生各阶段m6A的动态变化图谱。在早期生精细胞(gonocyte)内，敲除METTL3或METTL14均可导致RNA剪接、翻译及稳定性异常，进而造成睾丸中精原干细胞(spermatogonial stem cell，SSC)缺失[11,12]。而在较后期的精原细胞(即SSC分化后的type A1 spermatogonia)中，只有符合敲除METTL3和METTL14才能显著影响精子形成过程中关键基因的翻译，导致精子形成障碍。这一现象表明，METTL3和METTL14在精子形成过程中可能存在部分冗余[12]。除了METTL3和METTL14，m6A编码器METTL16——秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C. elegans) METT10在哺乳动物中的直系同源蛋白也对雄性生育能力至关重要。METTL16基因在秀丽隐杆线虫及小鼠生殖细胞中的缺失均能导致不育表型。当秀丽隐杆线虫培养于高营养条件下，METT10介导的m6A修饰能阻断重要剪接因子U2AF35识别3′剪接位点，进而抑制S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶转录本的正常剪接和翻译，而在HeLa细胞中也观察到m6A对U2AF35识别存在抑制作用，表明METTL16通过介导3′-末端剪接位点的m6A修饰调控剪接的机制在哺乳动物中保守[34]。

除了m6A编码器之外，m6A的多个读码器也是精子发生过程中的重要角色。精母细胞富集的YTHDF2介导精母细胞中的精原细胞特异性转录本的及时降解，从而确保精子发生过程中精原细胞向精母细胞的正常转变[54]。YTHDC1从胚胎时期起在生殖细胞中持续高表达，并对精原细胞的存活至关重要，其在小鼠雄性生殖细胞中的缺失会导致类似唯支持细胞综合征的表型[49]。在精母细胞粗线期(pachytene)高表达的YTHDC2在减数分裂进程中有重要作用，其在生精细胞中的缺失导致减数分裂相关基因表达异常及粗线期精母细胞的端粒异常聚集，进而导致细胞凋亡。尽管YTHDC2能特异识别m6A修饰，但有研究表明，YTHDC2在精子发生中的功能并不依赖其m6A识别功能，而是依赖其3′→5′ RNA解旋酶活性[13]。PRRC2A是2019年在脑发育过程中鉴定到的新型m6A读码器[64]，而其在睾丸中有更高表达，主要存在于精母细胞及圆形精子中。在小鼠雄性生殖细胞中特异敲除PRRC2A基因，小鼠精母细胞减数分裂异常、圆形精子核型异常并产生脱落，精母细胞及圆形精子均出现大量凋亡，小鼠不育。PRRC2A RIP-seq显示其靶标mRNA中存在精原特异基因及减数分裂相关基因。转录组、翻译组及IP-MS等数据进一步提示，PRRC2A可能通过与YBX家族蛋白的相互作用，介导精原特异基因转录本的降解，同时与FXR1、PABPC1、EIF4G3等翻译相关因子相互作用，促进减数分裂细胞周期及细胞分裂相关基因的翻译。PRRC2A的这种双向调控作用，区别于其在少突胶质细胞特化过程中单一的稳定作用，提示该双向调控功能可能是生殖细胞特异的[65]。

m6A的去甲基化酶(即擦除器) ALKBH5和FTO的缺失同样能导致小鼠精子发生障碍，提示m6A的动态可逆，即m6A的去除对于生精过程中的基因表达调控同样重要。ALKBH5于2013年在精子发生这一研究系统中被鉴定为哺乳动物中第二个m6A擦除器[129]。ALKBH5缺失的小鼠能正常存活，但会发生雄性小鼠不育、睾丸变小、生精异常、精母粗线期和中期细胞凋亡。ALKBH5介导的m6A去甲基化显著影响核斑(nuclear speckle)中mRNA加工因子的组装，促进mRNA的正常剪接。同时，ALKBH5介导的m6A去甲基化也可能调控精子形成过程中针对3′UTR较长转录本的选择性降解[43]。相较于ALKBH5，FTO在大脑而非睾丸中表达量较高。尽管如此，有研究表明，FTO介导的去甲基化可能调节雄激素受体(androgen receptor，AR)的翻译并促进睾丸间质细胞(Leydig cell)的成熟，从而影响未分化精原细胞的维持及精子发生[39]。

1.2 其他RNA修饰

除了丰度最高的m6A外，近年来的研究也表明了5-甲基胞嘧啶(5-methylcytidine，m5C)和N4-乙酰胞嘧啶核苷(N4-acetylcytidine，ac4C)在精子发生过程中的重要性。

m5C是指供体的一个活性甲基被添加到RNA中胞嘧啶碱基的第5位碳，也是一种广泛存在于mRNA和非编码RNA中的修饰。m5C的写入在哺乳动物中主要依赖于NOL1/NOP2/SUN(NSUN)结构域酶家族及DNA甲基转移酶2(DNMT2，又称tRNA天冬氨酸甲基转移酶1，TRDMT1)；而其去甲基化则主要由TET家族蛋白介导。m5C修饰能够被mRNA出核接头蛋白ALYREF及Y-box结合蛋白(YBX)家族蛋白特异性识别，进而影响RNA核质运输及稳定性等。小鼠m5C编码器NSUN2的缺失会导致小鼠不育，精子发生阻滞于减数分裂细线期及偶数期(leptotene and zygotene，LZ)阶段。在圆形精子中，NSUN2定位于雄性生殖细胞特有的无膜细胞器拟染色质体(chromatoid body，CB)，提示其在精子形成过程中可能存在生殖细胞特异的调控功能[131]。小鼠中NSUN7的功能缺失同样导致小鼠不育。但与NSUN2不同，NSUN7缺失的小鼠睾丸中并未观察到精子发生阻滞，但其成熟精子鞭毛灵活性受损，进而导致精子前向游动能力丧失[88]。与上述NSUN家族蛋白不同，DNMT2的缺失并不影响雄性生育能力；但其缺失能改变成熟精子中携带的小RNA表达谱。成熟精子中的小RNA被认为是表观代际遗传的潜在分子信息载体，能将父本环境暴露的信息如高脂饮食等传递给子代。因此，DNMT2介导的m5C修饰可能参与父本环境暴露信息的写入，调控表观代际遗传[89]。

RNA上的ac4C修饰由目前唯一已知的编码器——N-乙酰基转移酶10(NAT10)催化产生，其去除机制及特异性识别蛋白仍不清楚。研究显示，ac4C修饰具有调控mRNA稳定性及翻译效率等功能[4]。利用HPLC-MS/MS技术对小鼠多种组织中Total RNA和mRNA上的ac4C进行定量分析发现，与其他组织相比，睾丸和附睾的ac4C含量相对较高，且ac4C丰度在精子发生过程中高度动态变化，从精母细胞到圆形精子逐渐减少。小鼠雄性生殖细胞特异性敲除Nat10基因导致精原细胞分化及减数分裂启始异常，而少数能进入减数分裂的精母细胞也存在DSB修复异常及同源重组缺陷等，最终阻滞于粗线期阶段。需要指出的是，NAT10作为乙酰转移酶，其底物除了mRNA以外，还包括多种非编码RNA、组蛋白及细胞骨架蛋白等，其缺失所造成的影响并不等同于mRNA中ac4C的潜在功能[117]。同时，ac4C在mRNA中的丰度仍存在争议[132]，因此ac4C在精子发生中的功能仍需进一步研究。

此外，尽管已确定多个RNA修饰的编码器在精子发生过程中具有重要功能，m5C、ac4C以及假尿嘧啶(Ψ)等RNA修饰自身在生精过程中的动态变化及时空分布仍不完全清楚。

2 RNA修饰在卵子发生及着床前胚胎发育中的调控功能

卵子发生是指雌性原始生殖细胞(primordial germ cell，PGC)逐步发育为成熟卵细胞的过程，其基因表达调控与精子发生存在差异但同样极其复杂。雌性原始生殖细胞在胚胎期E13.5天进入减数分裂。出生后，未成熟的卵母细胞停滞在第一次减数分裂前期的双线期(diplotene stage)，并被周围单层扁平颗粒细胞包裹，形成原始卵泡作为卵巢的基本单位。原始卵泡在形成之后处于休眠状态。在外界信号的激活下，原始卵泡中卵母细胞进入快速生长和转录活跃状态，进一步发育为初级卵泡(primary follicle)、次级卵泡(secondary follicle)、有腔卵泡(antral follicle)和排卵卵泡(ovulated follicle)。在此期间，卵母细胞会恢复减数分裂，其特点是“生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)”。GVBD和第一次减数分裂完成后，卵母细胞排出第一极体并进入第二次减数分裂，进而阻滞于第二次减数分裂中期直到受精。

自完全生长的初级卵母细胞(full-grown oocytes，FGOs)开始，至合子基因组激活(zygotic genome activation，ZGA)之前，卵母细胞的转录基本处于沉默状态。因此，卵母细胞中储存的mRNA除了调控自身的成熟外，也是受精后、合子基因组激活前胚胎发育的必需资源，其中转录本翻译的时空调控精细而复杂。合子基因组激活即受精卵的转录激活，在受精卵分裂到特定发育阶段(小鼠为二细胞晚期，人类为8细胞时期)时被启动。与此同时，大量母源mRNA发生降解(maternal decay)，最终实现母源-合子转变(maternal-to-zygotic transition，MZT)，可见母源mRNA的及时降解是哺乳动物卵母细胞向受精卵发展的关键步骤。卵细胞及受精卵中RNA储存、翻译和降解的精细调控依赖于多种RNA修饰及其效应蛋白的共同参与，而卵母细胞及早期胚胎中RNA修饰异常或其效应蛋白功能丧失可能是人类卵子及胚胎发育异常的致病原因。

2.1 m6A

近年来多项研究发现，m6A修饰是卵母细胞成熟和母源-合子转变过程中基因表达调控的关键机制。储存在成熟卵子中的大量母源RNA都携带m6A修饰，且m6A修饰在早期胚胎发育过程中具有高度动态性[7,133]。近期一项研究利用单细胞m6A测序(scm6A-seq)发现二细胞时期两个卵裂球(blastomeres)的m6A修饰存在差异[134]，并可能与卵裂球合子基因组激活不同步现象相关。此外，在卵子成熟和早期胚胎发育过程中，多个m6A修饰相关蛋白都被证实具有重要功能。

m6A编码器METTL3对卵子的发生至关重要。在小鼠原始生殖细胞晚期特异性敲除METTL3基因，其卵巢形态异常，无明显的卵泡[20]；而在原始卵泡阶段敲除METTL3基因，卵母细胞无法完成GVBD(即不能恢复减数分裂)，且只有极少数卵泡能发育至初级阶段之后[20,135]。同时，这些卵母细胞中出现DNA损伤累积[135]和RNA降解异常[134]，受精后无法发育阻滞于二细胞阶段[8,20]。在二细胞胚胎的合子基因组激活后，METTL3介导的m6A对二至四细胞时期短暂表达的ZGA转录本的及时降解也具有调控作用[133]。在囊胚时期，METTL3是调控干细胞多能性(pluripotency)的关键因子。METTL3缺失的囊胚或原始态(naïve)胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)中m6A修饰丰度大幅下调，且无法完成原始态向始发态(primed)多能性的转变。大部分原始态多能性促进基因如Nanog和Klf2等都带有m6A修饰。在METTL3缺失的情况下，细胞中原始态多能性促进基因的转录本无法及时降解，从而稳定了原始态多能性的调控回路，由此推断，原始态多能性促进基因转录本上的m6A修饰可能介导其及时降解，使细胞能退出原始态，向始发态转变[136]。与METTL3缺乏类似，卵母细胞中缺乏METTL3/METTL14复合物的关键辅助因子KIAA1429也会导致GVBD和减数分裂恢复失败。KIAA1429缺失的卵母细胞表现出RNA的异常积累和剪接缺陷[31]。

除了编码基因外，逆转座子(retrotransposons)来源的转录本也是METTL3/METTL14复合物的靶RNA，如卵母细胞中高丰度转座子元件MTA(属于MaLR家族)、二细胞特异性表达的MERVL(属于ERVL家族)以及mESC中内源性逆转录病毒(endogenous retrovirus) IAPEz[47,48]等。卵细胞成熟及早期胚胎发育过程中逆转座子RNA丰度的动态变化对该过程非常重要，而这些RNA上的m6A修饰可能是其中的一种调控机制[133]。除了METTL3/METTL14复合物外，m6A编码器METTL16也是早期胚胎发育不可或缺的因素。小鼠16细胞胚胎中缺乏METTL16会导致其底物MAT2A(一种SAM合成酶)转录本丰度下降，进而在64细胞阶段出现转录组大规模异常，并在着床期前后出现发育停滞[35]。

许多已知的m6A读码器都曾以卵子发生或早期胚胎发育作为系统进行功能研究，且其中一些显示了其他读码器无法补偿的特有功能。YTHDF2可能是研究最为深入的m6A读码器，相较于其他读码器，其功能在卵母细胞和早期胚胎发育中尤为重要。当在原始卵泡阶段敲除YTHDF2基因，卵细胞可以发育为成熟卵子(即MⅡ时期)。然而，这些MⅡ卵母细胞受精后并不能正常发育。组学数据显示，部分带有m6A修饰且与YTHDF2结合的转录本应在GⅤ到MⅡ的转变过程中降解；但在YTHDF2缺失的情况下，这些转录本在MⅡ卵母细胞异常累积，最终导致受精后二细胞胚胎发育异常[55]。尽管YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3三种同源的m6A读码器被认为具有不同的分子功能；与YTHDF2不同，YTHDF1和YTHDF3缺失的小鼠仍能存活且可育，提示YTHDF1和YTHDF3功能缺失可由其他YTHDF读码器进行补偿[20]。YTH家族的另外两个读码器YTHDC1和YTHDC2在卵母细胞成熟过程中也有关键作用。YTHDC1缺失的卵母细胞发育阻滞于初级卵泡阶段[49]，研究显示，YTHDC1与3′-末端加工因子(如SRSF3等)共同调节卵母细胞中的多聚腺苷酸化(polyA)。而YTHDC2基因敲除雌性小鼠的卵母细胞发育阻滞于减数分裂粗线期之前，与雄性小鼠中精母细胞阻滞时期类似，提示YTHDC2在卵子发生中的作用可能与精子发生类似[9]。如上所述，逆转座子RNA也带有m6A修饰。逆转座子RNA和编码基因RNA上的m6A均可被IGF2BP2识别，进而促进其在卵母细胞中的稳定性[44,133]。

当m6A擦除器缺失时，卵母细胞和早期胚胎中的m6A不能及时去除，进而导致RNA代谢出现异常。首个被鉴定的m6A擦除器FTO缺失导致雌性小鼠无法产生健康存活的子代。利用小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)作为研究系统，发现FTO的去甲基化底物包括染色质相关RNA(caRNA)和逆转座子LINE1 RNA。FTO敲除的mESCs中，caRNA和LINE1 RNA上的m6A修饰异常累积，并进一步导致LINE1 RNA丰度降低、染色质开放程度降低以及转录活性降低等，最终引起mESC增殖及分化缺陷。m6A另一擦除器ALKBH5的缺失会导致卵母细胞中m6A修饰的异常累积。这些m6A修饰被IGF2BP2识别，进而增强RNA的稳定性，导致转录本异常累积及减数分裂缺陷[44]。

2.2 其他RNA修饰

m5C广泛存在于卵母细胞和早期胚胎的mRNA中，并且在调控卵细胞成熟和母源-合子转变中也起着关键作用。NSUN2敲除造成果蝇母源mRNA上m5C大规模丧失，进而导致受精后胚胎发育迟缓、母源-合子转变失败[137]。这一表型与先前研究在斑马鱼中干扰m5C读码器YBX1后看到的表型相互验证[94]，提示m5C在卵细胞成熟及早期胚胎发育中具有重要功能。同样的，在哺乳动物卵母细胞中NSUN5基因高表达，而NSUN5缺失的雌性小鼠卵巢中m5C水平显著下降，并影响部分基因(如MAD2L2、GDF9和BRD8等)的剪接及翻译，进而导致卵巢功能及胚胎发育缺陷[82]。得益于高通量单碱基m5C鉴定技术的发展，近来的研究显示，哺乳动物mRNA上存在两类m5C位点(Type Ⅰ和Type Ⅱ位点)，其编码器分别为NSUN2和NSUN6。NSUN2介导的mRNA上m5C位点倾向于在其3′-末端有一个富G的基序，类似于tRNA中的小颈环结构底部；而NSUN6介导的mRNA上m5C位点富集于(m5C)UCCA基序[84,85]。以卵细胞及早期胚胎为研究体系，相较于小鼠、果蝇等模式动物，人类母源mRNA上具有更多NSUN6依赖的m5C位点，提示表观转录组也具有物种特异性，并可能参与调控物种特异的发育过程[137]。

与精子发生类似，当在雌性原始生殖细胞中敲除ac4C编码器NAT10基因时，卵母细胞发育阻滞于第一次减数分裂粗线期；而在初级卵泡时期敲除NAT10基因，卵母细胞发育阻滞于次级卵泡时期。多种组学联合分析显示，NAT10介导的ac4C修饰可提升CCR4-NOT复合体中主要成分(如Cnot6l、Cnot7和Btg4)的翻译及稳定性，从而促进CCR4-NOT复合体介导的母源mRNA降解及转录组重塑。此外，NAT10介导的ac4C修饰还能提高部分看家基因的翻译效率[118]。综上，NAT10通过调控转录本翻译及稳定性、微调基因表达，从而在小鼠卵母细胞减数分裂重启、生长和成熟的过程中发挥关键作用。

3 RNA修饰在器官发生中的调控功能及在发育疾病中的致病机理

哺乳动物器官发生(organogenesis)是胚胎中细胞经过分裂、增殖、分化、迁移及程序性死亡等一系列行为，最终构成功能结构特异器官的复杂过程。一系列儿童和成人疾病，包括结构性出生缺陷及神经发育障碍等，都可能来源于胚胎时期发育异常。因此，了解器官发生的调控机制对于揭示发育疾病的起源至关重要，同时也为相关疾病的诊疗提供新的理论基础。近年来研究显示，RNA修饰也是器官发生的重要调控机制。

3.1 神经系统

3.2 心血管系统及肝脏

3.3 肌肉骨骼系统

4 总结与展望

4.1 RNA修饰之间的协同互作

4.2 非编码RNA上RNA修饰的调控作用

4.3 稀有细胞类型中RNA修饰位点、丰度及其作用

基金资助

中国科学院战略先导科技专项B类(XDB0570000)；国家重点研发计划项目(2021YFC2700200，2022YFC2702600)；国家自然科学基金项目(32170815，U23A20402，32300459)

--核糖核酸功能与应用专刊--

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