雷婷 侯晋 | RNA表观遗传修饰与免疫细胞功能调控

1.1.1 m6A修饰的生物学过程

m6A是一种RNA甲基化修饰，因其只存在于RNA腺嘌呤上的第6个氮原子的腺苷而命名。m6A甲基化修饰在20世纪70年代被发现，广泛分布于哺乳动物mRNA中。高通量测序表明，m6A主要富集在RNA的外显子、终止密码子和3ʹUTRs上，其最常修饰的基序是RRACH，其中R为鸟嘌呤或腺嘌呤，H为尿嘧啶、腺嘌呤或胞嘧啶[1]。m6A甲基化是一个动态、可逆的生物过程，主要受甲基转移酶“writer”和去甲基化酶“eraser”的调控，随后带有m6A甲基化修饰的RNA能够被特定的结合蛋白“reader”识别并结合，最终发挥相应的生物学作用，包括RNA的加工、翻译和稳定性。

编辑m6A修饰的“writer”主要由甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like protein 3，METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase-like protein 14，METTL14)和肾母细胞瘤1-相关蛋白(Wilms tumor 1 associated protein，WTAP)组成，三者构成复合体。尽管METTL3和METTL14都含有甲基转移酶结构域，但是由于METTL14的催化位点缺乏SAM结合基元，其主要功能是促进METTL3与RNA底物结合。WTAP本身无甲基转移酶结构，其主要负责维持METTL3-METTL4复合物的稳定性，进而促进RNA的m6A修饰[2]。除此之外，研究发现了许多新的m6A的“writer”，包括病毒样m6A相关的甲基转移酶(virus-like m6A methyltransferase associated，VIRMA)、RNA结合蛋白15(RNA binding motif protein 15，RBM15)、甲基转移样蛋白16(methyltransferase like protein 16，METTL16)、包含CCHC结构域的四号锌指蛋白(zinc finger CCHC domain containing 4，ZCCHC4)、锌指含CCCH结构域蛋白13(zinc finger CCCH domain containing protein 13，ZC3H13)、CBL原癌基因样蛋白1(CBL proto-oncogene like protein 1，CBLL1)等(表1)[3]。

然而，已有文献证明m6A是真核细胞中首个被发现的可逆RNA修饰，它可以被m6A相关“eraser”蛋白清除，包括FTO和ALKBH5[3]。FTO通过将RNA中的m6A氧化成N6-羟甲基腺苷和N6-甲酰基腺苷，进一步将其中间产物水解成腺嘌呤来发挥去甲基化作用。相反，ALKBH5能够直接去除m6A修饰的腺苷而不产生中间产物(表1)[4]。

m6A修饰介导的生物学功能在很大程度上依赖于结合蛋白“reader”的识别，其“reader”主要包括含YTH功能结构域的蛋白、核内不均一核糖核蛋白hnRNPs和胰岛素样生长因子2-mRNA结合蛋白家族IGF2BPs[3]。YTH域家族蛋白包括YTHDF1-3和YTHDC1-2。YTHDF1通过招募真核翻译起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，eIF3)到mRNA上的m6A位点，进而促进mRNA的翻译[5]。相反，YTHDF2能够促进带有m6A修饰的RNA发生降解，包括两种不同的机制：一是YTHDF2通过招募脱腺苷化复合物CCR4-NOT，使带有m6A修饰的RNA脱去腺苷酸化进而发生降解；二是YTHDF2通过促进热反应蛋白12(heat-reponsive protein 12，HRSP12)介导的RNA内切核糖核酸酶途径进而对RNA进行裂解，YTHDF2通过何种机制降解mRNA取决于带有m6A修饰的RNA是否具有HRSP12结合位点。但是尚不清楚这两种途径能否发生协同作用进而调节mRNA的降解[6]。相较于YTHDF1和YTHDF2蛋白，YTHDF3主要发挥辅助作用，它能够协同促进YTHDF1或YTHDF2的功能进而导致mRNA的翻译或降解[7]。此外，仍有一些其它的m6A的“reader”，如目前发现的唯一存在于细胞核的“reader”——YTHDC1，它主要通过结合丝氨酸/精氨酸剪接因子3(serine/arginine-rich splicing factor 3，SRSF3)进而促进mRNA的剪接[8]。尽管目前发现的m6A“reader”蛋白种类十分繁杂，但是这些蛋白质发挥作用都是通过促进带有m6A修饰的RNA翻译、降解和可变剪切，最终调节机体内功能蛋白的表达，以维持机体生理状态的稳定(表1)。

1.1.2 m1A修饰的生物学过程

与m6A修饰类似，RNA腺嘌呤第1个氮原子发生的甲基化修饰被称为m1A修饰。m1A在转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)中表达丰度最高，且常在tRNA的第58位腺苷酸发生修饰[9]。在生理条件下，m1A带正电荷，从而对RNA自身的结构或与蛋白质之间的相互作用进行调控。此外，m1A修饰可以阻断RNA中A-T或A-U的正常碱基配对，进而形成Hoogsteen碱基对，最终改变RNA自身的二级结构[10]。m1A几乎参与了RNA全部生物学过程，包括RNA的稳定性、剪接、折叠、输出、运输和蛋白质翻译效率，其发挥作用也是由“writer”“eraser”和“reader”介导(表2)。m1A修饰的“writer”主要是tRNA甲基转移酶(tRNA methyltransferase，TRMT)，机制研究发现在TRMT6/61A介导的m1A修饰过程中，具有甲基转移酶活性的TRMT61A从细胞浆转移到细胞核并与TRMT6结合，从而对TRMT6招募的tRNA进行甲基修饰，最终二者协同发挥作用[11]。m1A修饰的“eraser”主要由ALKBH1、ALKBH3、ALKBH7、FTO等去甲基化酶组成，它们发挥作用的机制不同，ALKBH家族分子能够直接去除RNA上的甲基基团，而FTO通过氧化反应抑制甲基转移酶的活性进而发挥作用[12]。m1A修饰与m6A修饰具有十分相似的特征，m1A在碱性环境中可以转变为m6A，且二者能够被一些相同的“reader”蛋白所识别进而发挥功能，如YTHDF家族蛋白和YTHDC1[13]。

1.1.3 m5C修饰的生物学过程

m5C因只存在于RNA胞嘧啶上的第5个碳原子而命名。m5C修饰主要存在于tRNA和rRNA上，少量存在于mRNA和非编码RNA(ncRNA)中。mRNA的m5C甲基化可以增加其稳定性进而促进其表达丰度[14]。负责m5C修饰的蛋白质包括带有NOL1/NOP2/SUN结构域的NSUN家族蛋白和tRNA天冬氨酸甲基转移酶1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1，RDMT1)。mRNA的m5C修饰主要由NSUN2催化产生；而NSUN3和NSUN4主要位于线粒体内，分别对线粒体中的tRNA和rRNA进行m5C修饰[15]。m5C的“eraser”主要为ALKBH1和TET家族蛋白。ALKBH1通过直接去除RNA上甲基基团的功能发挥m5C清除作用。而TET家族主要是将m5C氧化为5-羟甲基胞苷来发挥去甲基化作用[16]。介导m5C识别的蛋白质主要为Aly/REF输出因子(Aly/REF export factor，ALYREF)和Y盒结合蛋白1(Y-box binding protein 1，YBX1)。细胞核中带有m5C修饰的mRNA在ALYREF和NSUN2酶的介导下出核进入细胞质，进而招募YBX1来增强其mRNA的稳定性(表3)[17]。

1.2 不可逆的RNA表观遗传修饰的生物学过程

RNA不可逆修饰主要包括腺苷-肌苷(adenosine-to-inosine，A-I)转换和假尿苷(pseudouridine，PU)修饰。

1.2.1 A-I转换的生物学过程

A-I转换常见于tRNA，在A-I转换过程中tRNA上C6位置的腺苷会转变为肌苷，机制研究表明，RNA腺苷脱氨酶(adenosine deaminase accing on RNA，ADAR)能够结合RNA分子的双链区域，进而将腺苷脱氨成肌苷，最终肌苷在翻译时会被识别为鸟苷，导致遗传信息发生腺嘌呤到鸟嘌呤的改变[18]。在哺乳动物中，ADAR蛋白家族有3个成员，它们结构相似，包括N端与双链RNA结合的结构域和C端脱氨酶结构域。亦有文献表明，ADAR3(adenosine deaminase actingon RNA 3)对A-I转换有抑制作用[19]。

2 不同种类RNA表观遗传修饰在免疫细胞中的作用

RNA表观修饰参与免疫细胞的分化、发育、活化、迁移、极化等多种生物学过程，尤其在维持免疫细胞稳态和功能中发挥重要作用(表4)。

2.1 RNA表观遗传修饰在巨噬细胞中的作用

巨噬细胞具有包括清除受损或死亡的细胞和在免疫应答中向适应性免疫细胞呈递抗原在内的多种功能。M1型巨噬细胞主要产生干扰素γ(interferon γ，IFN⁃γ)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等炎症因子来介导炎症发生，而M2型巨噬细胞主要通过产生白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)、IL-10等炎症抑制因子来发挥抗炎活性。巨噬细胞中RNA的m6A修饰能够激活巨噬细胞、调节巨噬细胞的极化和启动促炎反应。有文献报道，甲基转移酶METTL3通过对STAT1、MALAT1、IRAK-M、NOD1以及RIPK2的mRNA进行m6A修饰，进而促使M1型的巨噬细胞激活并发挥促炎活性。机制研究表明，STAT1 mRNA的m6A修饰水平增加促进了其mRNA的稳定性，促使STAT1蛋白翻译增加，进而使得巨噬细胞向M1型转变，发挥促炎活性[24]。另一方面，MALAT1 mRNA的m6A修饰水平增加亦可增强其mRNA的稳定性，随后MALAT1与多聚嘧啶区结合蛋白1(polypyrimidine tract binding protein 1，PTBP1)相互作用促进泛素特异性蛋白酶8(ubiquitin-specific petidase 8，USP8)的降解，USP8负责转化生长因子-β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)的降解，MALAT1 mRNA的m6A修饰最终通过促进TAK1的表达从而促进M1型巨噬细胞活化[25]。此外，IRAKM mRNA的m6A修饰亦能通过介导其mRNA降解进而正向促进Toll样受体4(Toll-like receptors 4，TLR4)信号通路和M1型巨噬细胞激活[26]。除了METTL3以外，去甲基化酶FTO介导的去m6A修饰过程亦在巨噬细胞激活方面发挥十分重要的作用。FTO介导的去m6A修饰通过抑制YTHDF2介导的mRNA的降解，增加STAT1和PPAR的表达并促进核转录因κB(nuclear factor κ gene binding，NF-κB)信号通路的活化，最终促使M1型和M2型巨噬细胞共同激活[27]。亦有文献表明，其他RNA表观遗传修饰能够促进M2型巨噬细胞的活化，如腺苷转移酶ADAR1(adenosine deaminase acting on RNA 1，ADAR1)通过对miR-21的前体序列(pre-miR-21)进行A-I修饰从而减少成熟miR-21的产生，最终上调IL-10的表达并促进M2型巨噬细胞的活化[30]。RNA表观遗传修饰通过影响免疫细胞对抗病毒关键因子的表达从而在抗病毒天然免疫反应中发挥重要作用，如在巨噬细胞中，m6A表观遗传修饰通过调控cGAS、STING、IFI16、FOXO3等抗病毒分子的表达来抑制病毒复制[28,29]。

2.2 RNA表观遗传修饰在树突状细胞中的作用

树突状细胞是一类负责摄取、加工和提呈抗原的免疫细胞[45]。未成熟的树突状细胞具有较强的迁移能力，在摄取抗原后转化为成熟的树突状细胞。成熟的树突状细胞可刺激活化T细胞，促进适应性免疫应答反应。m6A修饰参与树突状细胞的活化和抗原交叉递呈过程：一方面树突状细胞中的CD40、CD80和TIRAP等mRNA带有m6A修饰，可以被YTHDF1识别并促进其翻译，最终增强了树突状细胞介导的T细胞活化，并促进了TLR4/NF-κB信号通路介导的炎性细胞因子的表达[31]；另一方面，YTHDF1通过结合LAPTM5、CTSS mRNA的m6A修饰位点并促进其翻译，促使加工后的抗原被降解，进而抑制了CD8+ T细胞的激活并导致免疫识别缺陷[32]。此外，有研究表明，lncRNA的m6A修饰在树突状细胞的迁移中发挥重要作用[33]。在静息状态下，带有m6A修饰的Lnc-Dpf3 RNA被YTHDF2识别后发生降解。而在炎症状态下，CCR7诱导Lnc-Dpf3 RNA的m6A修饰减少，进而增加了Lnc-Dpf3的表达并激活了Lnc-Dpf3介导的树突状细胞迁移，最终防止过度炎症反应的发生以维持免疫平衡[33]。

2.3 RNA表观遗传修饰在自然杀伤细胞中的作用

自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)能够通过分泌细胞因子来实现杀伤功能，在免疫调节中发挥十分重要的作用。m6A修饰在NK细胞的增殖、生存和效应生物学过程中至关重要。在白细胞介素15(interleukin-15，IL-15)介导的NK细胞成熟过程中，METTL3介导的m6A修饰通过促进SHP2的表达进而激活蛋白激酶Ｂ(protein kinase B，PKB，又称AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/细胞外信号调节激酶(extra cellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路以维持NK细胞的成熟和稳态[34]。此外，YTHDF2受IL-15的下游转录激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)的调控，从而降低TDP-43的mRNA稳定性来调控NK细胞的增殖与分裂，并通过调控NK细胞分泌穿孔素、颗粒酶、干扰素-γ来调节免疫应答[35]。

2.4 RNA表观遗传修饰在T淋巴细胞中的作用

T淋巴细胞主要参与适应性免疫应答，不同的RNA表观遗传修饰在调节T细胞介导的免疫应答中发挥多样的作用。m6A修饰能够调控T细胞的稳态和分化，机制研究表明METTL3介导的m6A修饰通过诱导SOCS家族的SOCS1、SOCS2、SOCS3和CISH mRNA发生降解，进而减弱其对IL-7/酪氨酸激酶(Janus kinase，JAKs)信号通路和白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)/STAT5信号通路的抑制作用，最终诱导初始T细胞向Th17细胞分化和增殖并且维持了调节性T细胞(Treg)的抑制功能[36,37]。此外，RNA表观遗传修饰能够调控胸腺T淋巴细胞的成熟，如A-I修饰的“writer”ADAR1在胸腺T淋巴细胞成熟过程中表达上调，其介导的A-I修饰异常会导致ISG过度表达，从而导致T细胞受体(T cell receptor，TCR)信号转导受损，影响胸腺T淋巴细胞阴性选择以及胸腺T淋巴细胞的成熟[38]。研究发现，其他的RNA修饰在T细胞的增殖分化过程中亦发挥着重要的作用，如在早期CD4+ T细胞激活阶段，TRMT61A/TRMT6介导的tRNA的m1A修饰通过促进MYC蛋白表达使得T细胞激活并扩增，促使机体在短时间内做出免疫反应[9]；又如在高同型半胱氨酸血症中，NSUN2介导的IL-17A mRNA的m5C修饰增强了IL-17A的翻译，进而促进了T淋巴细胞的活化并发挥免疫活性[46]。异常的RNA表观遗传修饰会影响T淋巴细胞的功能，进而促进疾病的发生发展。如在T细胞转移性移肠炎中，去甲基化酶ALKBH5的缺乏增加了对INF-γ和CXC趋化因子配体12(C-X-C chemokine ligand 12，CXCL12) mRNA的m6A修饰，从而降低其稳定性和蛋白质的表达，并最终导致机体CD4+ T细胞的免疫应答减弱[39]。此外，系统性红斑狼疮患者的CD4+ T细胞中NSUN2介导的m5C修饰水平显著降低，从而影响T淋巴细胞的增殖和分化，并导致免疫系统的功能紊乱[47]。亦有文献表明，结肠癌患者中CD8+ T细胞的增殖与其m1A总体修饰水平呈负相关[40]。

2.5 RNA表观遗传修饰在B淋巴细胞中的作用

B淋巴细胞主要通过介导体液免疫进而在适应性免疫中发挥重要作用。m6A修饰可以调控B淋巴细胞的早期发育。带有m6A修饰的细胞周期相关mRNA通过与YTHDF2结合并发生降解，进而促进IL-7介导的祖B细胞向大前B细胞转变[41]。此外，ADAR1介导的A-I修饰是骨髓中B淋巴细胞分化和发育所必需的，ADAR1缺乏抑制了IL-7介导的骨髓来源的前体B细胞向未成熟B细胞的分化[44]。B细胞生发中心是机体生成抗体的重要场所。研究表明，m6A修饰在B细胞生发中心形成过程中发挥关键作用。机制研究表明，YTHDF2降解带有m6A修饰的LAX1和TIPE2，进而抑制了MAPK和NF-κB信号通路，最终促进了生发中心的形成[42,43]。B淋巴细胞中异常的RNA表观遗传修饰也会促进疾病的发生发展。研究表明，去甲基化酶FTO表达增加减少了热休克转录因子1(heat shock transcription factor 1，HSF1)的甲基化修饰水平，进而导致HSF1的稳定性增加并促进了多发性骨髓瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[48]。

3 总结与展望

RNA表观修饰是指RNA在转录后通过一系列酶的介导发生的化学改变，进而影响RNA的结构和功能来调节蛋白质的表达及其介导的细胞活动。RNA表观遗传修饰亦在免疫细胞功能调控中扮演重要角色，其通过调控RNA的生物学过程，包括提高RNA翻译效率、降低或增强转录本的稳定性、调控mRNA的剪接和核外运输，从而参与免疫细胞的分化、活化、迁移、极化等多种生物学过程并调节免疫应答，最终参与免疫相关疾病的发生发展。目前，对于RNA表观遗传修饰通过调控蛋白的表达从而在免疫细胞中发挥多元功能已有诸多的研究进展，然而，在相同的免疫细胞中不同类型的RNA表观遗传修饰是否通过RNA表观调控进而发挥协同或者拮抗作用，以及其他类型的RNA，如tRNA、rRNA、lncRNA和miRNA的表观遗传修饰在免疫细胞调控中的作用仍然所知甚少。并且，靶向RNA表观遗传修饰作为免疫相关疾病的治疗目前仍在探索阶段，还没有临床应用。因此，全面深入地研究RNA表观遗传修饰及其生物学过程与免疫细胞之间的相互作用关系，有助于为临床免疫治疗提供新的思路和依据。