薛梅 孙琳 | KRAS基因突变在子宫内膜异位性疾病中的作用

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子宫内膜异位性疾病(endometriosis disease，EMD)包括子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)和子宫腺肌病(adenomyosis，AM)，两者都属于雌激素依赖的慢性炎症性疾病，其组织学表现为子宫内膜腺体和间质在宫腔外种植生长，以严重的慢性盆腔痛、痛经、性交困难以及不孕症为主要症状[1,2]。现有药物和手术方式治疗EMD的效果不佳，寻找新的诊断和治疗方式尤为重要。

二代测序(next-generation sequencing，NGS)是目前高通量DNA和RNA测序技术的总称，其应用包括全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)、全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)以及其他基因组规模或靶向深度测序方法，广泛应用于各种肿瘤的研究。近年来，NGS技术在EMD领域的研究也逐渐增多[3-5]。研究发现，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)是EMD体细胞突变中最常见的突变基因之一。全基因组关联研究表明，具有高突变频率的KRAS等位基因突变占EMs基因突变的38%[6]。

本文综述KRAS基因及其介导的信号转导通路，阐述目前子宫内膜异位性疾病中发现的KRAS基因突变，以期为进一步研究KRAS基因突变与子宫内膜异位性疾病关系提供思路，为EMD的诊断和治疗提供参考依据。

1 KRAS基因

1.1 KRAS的生物学功能

KRAS基因编码的KRAS蛋白(包括KRAS 4A和KRAS 4B两种亚型)是一种小的鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)水解酶，存在4个结构域，其中氨基(N)端的前两个结构域共同组成了G结构域，该结构域与GTP结合并激活信号转导；而KRAS蛋白的羧基(C)端指导翻译后修饰并确定质膜锚定，在调节RAS蛋白的生物活性中起着重要作用[7]。

KRAS蛋白存在两种不同的构象，分别结合活性GTP和非活性鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)，这两种构象可以在鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)和GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins，GAP)的作用下不断转换，进而参与从细胞表面受体到细胞内部信号转导的过程，在细胞生长、增殖、分化和凋亡等过程中发挥重要作用[8]。

1.2 KRAS参与的信号转导通路

目前关于KRAS蛋白参与的信号转导通路研究较为深入的有RAS-RAF-丝裂原激活的蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)-细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)途径和磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(phosphoinositide dependent protein kinase 1，PDK1)-蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)途径。

细胞内RAS-RAF-MEK-ERK信号级联是MAPK(丝/苏氨酸蛋白激酶)通路的四种主要分支之一，将生长因子、激素、促肿瘤物质和分化因子等细胞外分子转化为细胞内信号，用于调节细胞增殖、分化和存活[9]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种酪氨酸激酶受体(receptor of tyrosine kinase，RTK)，可激活RAS，使RAS-GDP转化为RAS-GTP，并将Raf或Raf/MEK异二聚体募集到质膜上，同时激活Raf，Raf C端的催化结构域可以激活MEK，MEK是一种罕见的双特异性激酶，激活后的MEK进一步激活ERK1/2使其从细胞质转移到细胞核内，通过磷酸化调节各种转录因子的活性，而后转录因子诱导基因表达以响应细胞外刺激，并调节细胞增殖、分化、凋亡和转录，最终调节细胞的代谢和功能，影响细胞的特定生物学效应[10]。EGFR作用于RAS-RAF-MEK-ERK的具体途径见图1。ERK1/2的诱导是上皮-间充质转化的必要步骤，在多种疾病的纤维化过程中起着关键作用，KRAS激活可以促进上皮-间充质转化[11]，而上皮-间充质转化则是EMs发生、发展的重要环节[12]。因此，KRAS蛋白的激活对于子宫内膜异位性疾病的发生发展起促进作用。

图1 EGFR与RAS-RAF-MEK-ERK途径

PI3K/AKT通路是一种细胞内的信号通路，与多种正常细胞和肿瘤细胞的功能有关，在许多良、恶性疾病的发生、发展中发挥重要作用[13]。细胞膜中的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2)可被PI3K磷酸化形成一种第二信使——磷脂酰肌醇-3,4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3)，PIP3可将含有其pleckstrin同源性(PH)结构域的蛋白质募集到质膜上。在PI3K/AKT通路中，PIP3的3位磷酸基团将磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(phosphoinositide dependent protein kinase 1，PDK1)和AKT蛋白同时招募到质膜上，使PDK1磷酸化AKT蛋白的308号位的苏氨酸(T308)，导致AKT部分活化。此外，mTOR复合物2(mTORC2)及DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)等可完全活化AKT，活化后的AKT可调节多种下游通路，包括mTOR、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、MAPK等[14]。KRAS 4B亚型是PI3K/AKT通路有效的激活剂[15]。现有研究指出，子宫内膜异位症患者的在位及异位内膜中PI3K表达增加，AKT磷酸化水平增强，且在轻度子宫内膜异位症中磷酸化水平更强[16]。这也证明了PI3K/AKT通路在子宫内膜异位症发生阶段中的影响。此外，动物实验也验证了这一结论，而作为其上游蛋白的KRAS蛋白可通过PI3K/AKT通路影响子宫内膜稳态、增加血管通透性。PI3K/AKT通路的激活与子宫内膜异位症的炎症反应存在正相关，也证明了其在子宫内膜异位性疾病发生发展中的作用[17,18]。

2 KRAS基因突变与子宫内膜异位性疾病

2.1 子宫内膜异位性疾病中的KRAS基因突变

许多研究证明，子宫腺肌病及子宫内膜异位症患者的在位及异位子宫内膜组织中存在KRAS基因突变。Inoune等[19]利用二代测序技术对子宫腺肌病患者的病灶组织及其邻近组织样本进行了全基因组分析，发现部分子宫腺肌病患者的正常组织、病灶组织以及合并的子宫内膜异位症病灶中均出现了KRAS突变。这一现象提示，正常组织产生的KRAS基因突变可能导致其增殖、侵袭能力的增强，促使该组织异位生长并导致子宫腺肌病的生成，也证明子宫腺肌病中KRAS突变的存在与子宫内膜异位症的合并发生有关。2011年，Vestergaard等[20]对23名子宫内膜异位症患者的子宫内膜组织的DNA测序中，发现其中一名患者的异位内膜组织中KRAS密码子12发生突变，导致甘氨酸残基被半胱氨酸取代。

KRAS基因是子宫内膜异位症上皮细胞中最常见的突变基因，异位子宫内膜中的KRAS突变后具有更高的侵袭性和存活能力，这有助于它们在子宫肌层组织内的侵袭和生长，从而形成子宫腺肌病及子宫内膜异位症[21]。KRAS蛋白可以被多种因子激活，包括转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、血管紧张素Ⅱ、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、内皮素-1、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)和凝血酶，这些因子或其受体在异位内膜组织中的表达存在不同程度的上调[22]。Anglesio等[23]通过外显子组测序、靶向扩增子测序等方法对三名深部浸润性子宫内膜异位症患者的内膜组织进行了基因组测序，发现有两名患者的异位内膜上皮存在KRAS基因突变激活，其中一名患者同一解剖部位中存在两种不同的突变类型c.35G→T(p.G12V)和c.35G→C(p.G12A)。另一患者具有单个KRASc.35G→A(p.G12D)突变，且三个不同解剖部位的异位内膜上皮中发现了相同的KRAS c.35G→A改变，这一现象引出了一个具有争议的问题：深部浸润性子宫内膜异位症是否可以被视为良性肿瘤。该研究证明，正常子宫内膜中产生的PIK3CA或KRAS突变可能参与了子宫内膜异位症的细胞起源。

台湾学者检测到4/17名子宫腺肌病患者携带KRAS基因的p.Gly12Asp和p.Gly12Ala突变，这两个突变具有致病性，是肿瘤组织中最常见的KRAS改变之一[21]。Yetimalar等[24]在4名伴发子宫腺肌病和子宫内膜增生的女性中发现，1名女性携带致病性KRAS突变。这些发现证实KRAS突变可能导致不同形式的子宫内膜相关疾病。上述研究不难发现，子宫内膜异位性疾病中的KRAS基因突变是非常普遍的现象，而这些突变对疾病发生发展的影响仍然是目前的热点话题。

2.2 KRAS基因突变对子宫内膜异位性疾病发生发展的影响

活化的KRAS可以配合锌指转录因子Snail通过干细胞因子诱导和肥大细胞浸润增强促进纤维化，已有的研究证明了子宫内膜异位症女性腹腔液中的干细胞因子水平升高，在子宫内膜异位病变中也可以观察到实质损伤、原纤维细胞外基质积聚、成纤维细胞积聚、微脉管系统稀疏和单核浸润，而这些特征是纤维化疾病的共同点[25,26]。

有研究者建立了永生化的HMOsisEC10(人卵巢子宫内膜异位上皮细胞系)并培养出其KRAS和PIK3CA基因突变细胞，蛋白印迹分析发现HMOISEC10 KRAS突变细胞中RAS/ERK信号通路被强烈激活，而PI3K/AKT信号通路在HMOISEC10 PIK3CA突变细胞中被激活。随后的体外迁移测定、侵袭和增殖实验都证明了两种突变细胞系的迁移、侵袭和增殖能力均显著高于未发生基因突变的细胞系[27]。KRAS基因突变后赋予了内膜细胞更强的转移能力，促进了子宫内膜异位症的发展。

Orr等[6]通过一项前瞻性队列研究比较了122名子宫内膜异位症患者的分期，确定KRAS密码子12突变会导致子宫内膜异位症更高的解剖分期，增加输尿管黏连的风险，并提高手术难度。有趣的是，先前已经证明KRAS基因突变发生在超过四分之一的子宫内膜异位症病例中，且良性疾病的子宫内膜样本中比子宫内膜癌样本中更普遍。除此之外，该研究还发现，在正常子宫内膜细胞中KRAS突变率随着年龄的增长而增加，但在子宫内膜癌样本中却相反[28]。这表明KRAS的早期激活也可能诱导子宫内膜细胞衰老，从而抑制恶性转化的进展[29]。子宫腺肌病的KRAS突变通过提高孕激素受体(progestogen receptor，PR)启动子甲基化水平，导致PR表观遗传沉默，从而使两种孕激素受体PR-A和PR-B下调，降低地诺孕素的抗增殖作用，影响地诺孕素对子宫腺肌病的治疗效果[27]。该实验的不足之处在于研究者使用的是永生化的人子宫内膜细胞而非其他独立细胞系或者提取自患者的原代细胞，将来可使用原代细胞进一步研究以获得准确结果，以确定这种基因突变是否与评估接受孕激素治疗或联合手术治疗的患者的潜在复发风险有关。

3 结语与展望

近年来，二代测序技术逐渐成熟，越来越多的基因测序技术被应用到子宫内膜异位性疾病的研究中。与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜异位性疾病患者KRAS基因突变后的子宫内膜细胞具有更强的增殖、侵袭和转移能力，使得子宫内膜异位性疾病具有类似恶性肿瘤的行为。但目前只有少量研究讨论了KRAS基因与子宫内膜异位性疾病的关系，而且大部分停留在二代测序确定基因突变的研究层面，并未进行深入的研究。二代测序技术的发展虽然促进了各类疾病基因突变相关的研究，但在子宫内膜异位性疾病中也只是局限于基因表达的部分，并不能够阐明KRAS基因突变的原因，也未能证明KRAS蛋白在子宫内膜异位症发生发展中的具体通路。尽管有限的研究中提及了KRAS基因突变对子宫内膜异位性疾病的影响，但无法证明产生这种影响的机制。未来可深入研究KRAS基因突变对子宫内膜异位性疾病发生、发展的作用，具体到某个通路或者某类因子，进一步完善KRAS基因下游通路，以进一步揭示子宫内膜异位性疾病的发病机制。

目前研究发现，子宫内膜异位症相关卵巢癌中也存在KRAS基因的突变，而这种突变是否与子宫内膜异位症恶变相关仍存在疑问，把研究KRAS基因突变与子宫内膜异位症的恶变是否有关及其作用机制作为一个研究方向，在预防及预测子宫内膜异位症恶变领域也可发挥重要作用。

第三版的《子宫内膜异位症诊治指南》提到，子宫内膜异位症是妇科常见的慢性疾病之一，普遍存在诊断延迟的情况。诊断延迟则可导致病情加重，进一步影响疾病的治疗与预后，增加复发风险，降低患者的生命质量，因此对子宫内膜异位性疾病的早诊断、早治疗就显得尤为重要[30]。进一步研究KRAS基因与子宫内膜异位性疾病发生和发展的关系，寻找相关通路，通过沉默或者上调其下游通路因子的表达，可为子宫内膜异位症及子宫腺肌病早期诊断、早期治疗及预防复发提供新思路，为子宫内膜异位性疾病的靶向治疗提供参考依据，大大降低子宫内膜异位性疾病给患病女性带来的负面影响，提高患者的生活质量。