武大/华科孙宇辉组Nat Commun | 链霉菌基因组编辑新工具促进天然产物生物合成路径重构与改造

学术 2024-07-08 09:36 日本

遇见/背景

链霉菌（Streptomyces）是抗细菌、抗真菌和抗寄生虫等药物的重要来源。为了探索和挖掘链霉菌丰富的天然产物生物合成基因簇（Biosynthetic gene clusters, BGCs），人们一直倚重于经典的同源重组基因编辑技术。然而，链霉菌独特的高GC含量，以及培养和遗传操作周期耗时长、效率低，使得成功获得突变株往往需要付出高昂的时间和人力成本。如何高效且简便地进行微生物基因组定向编辑，成为人们进行微生物天然产物研究与开发的迫切期待。随着CRISPR/Cas技术的兴起和发展，应用于链霉菌相关基因编辑技术的突破，有望成为加速发现、改造和高产活性天然产物的新方法。

遇见/内容

2024年7月7日, 武汉大学/华中科技大学孙宇辉研究组在Nature Communications上发表题为“Engineered cytosine base editor enabling broad-scope and high-fidelity gene editing in Streptomyces”的研究论文。该论文开发的eSCBE3-NG-Hypa胞嘧啶单碱基编辑器，可在链霉菌中识别更广泛的NGN PAM位点的同时，对高GC含量或含有GC基序的靶点实现高效且高保真的基因编辑。而且，本研究还以阿维菌素工业高产菌株作为示例，利用该单碱基编辑器在极具挑战性的高度序列同源性的阿维菌素聚酮合酶（Polyketide synthase, PKS）结构域中实现了精准且高保真的氨基酸转变；同时，还利用单碱基编辑技术介导的终止密码子提前引入的策略实现了阿维菌素的高产，将为聚酮化合物的高产和结构创新提供了可借鉴的工具和方法。

基于CRISPR/Cas发展起来的胞嘧啶单碱基编辑器（Cytosine base editor, CBE）一般由胞嘧啶脱氨酶（Cytidine deaminase）、Cas蛋白（例如SpCas9）和尿嘧啶糖苷酶抑制蛋白（Uracil glycosylase inhibitor, UGI）三部分组成，可在不引入DNA双链断裂（DNA double-strand break, DSB）的情况下实现C→T的单碱基编辑（图1a）。然而，现有链霉菌单碱基编辑技术存在的可编辑靶点有限（受限于NGG PAM）、链霉菌基因组高GC含量和高度同源性带来的脱靶效应，以及难以编辑GC基序等困境，限制了该技术的有效应用。高保真SpCas9（SpCas9-HF1或HypaCas9）和识别NGN PAM的SpCas9-NG为开发兼具高保真性和靶点宽泛性的胞嘧啶单碱基编辑器带来了新的启发和可能。该研究将来自高保真SpCas9或SpCas9-NG的功能性氨基酸突变引入CBE3系统，开发出了碱基编辑器SCBE3-NGs (SCBE3-NG, SCBE3-NG-HF1, SCBE3-NG-Hypa和SCBE3-NG-HF1-Hypa)（图1b）。

图1. 链霉菌单碱基编辑器的工作原理及相关设计

尽管SCBE3-NGs在16个含有不同NGN PAM的位点处实现了有效单碱基编辑，但是在面对具有NGA / NGC PAM或高GC含量的位点时，其编辑效率仍较低（图2）。然而，高GC含量的基因组序列是链霉菌的内在秉性，克服单碱基编辑器在高GC含量位点处的低效性十分必要。因此，本研究利用高活性的脱氨酶hAPOBEC3A(Y130F)替换了SCBE3-NGs系统中的脱氨酶rAPOBEC1，开发出适合链霉菌的高效单碱基编辑器eSCBE3-NGs (eSCBE3-NG, eSCBE3-NG-HF1, eSCBE3-NG-Hypa和eSCBE3-NG-HF1-Hypa)（图3）。相比于SCBE3-NGs，eSCBE3-NGs编辑效率得到全面提升，即使在GC含量高达85%的位点（图2）。

图2. 识别NGN PAM的单碱基编辑器的编辑效率考察

图3. 链霉菌高效单碱基编辑器的组成与设计

图4. eSCBE3-NG-Hypa在全基因组和转录层面上的高保真性靠考察

基于全基因组和转录层面的脱靶效应考察发现，eSCBE3-NG-Hypa在群体细胞中不仅保持了高效的靶点编辑效率，而且还具有较低的基因组脱靶效应，以及在转录层面仅有本底水平的脱靶效应（图4）。同时，通过进一步考察eSCBE3-NG-Hypa的编辑特异性，发现eSCBE3-NG-Hypa可在5 ~ 9编辑窗口（将靶点序列的PAM远端的第一个碱基定义为1）内实现GC基序的高效编辑以及低旁观者编辑（Bystander activity）（图5）。

图5 对eSCBE3-NG-Hypa编辑窗口和编辑特异性考察

鉴于eSCBE3-NG-Hypa在链霉菌编辑效率、脱靶效应和编辑特异性等方面的突出表现，该研究进一步考察了其在工业链霉菌应用场景下的实用性。聚酮合酶作为活性天然产物生物合成的核心“分子机器”，其模块化的催化结构域在氨基酸和核苷酸层面上具有高度的序列同源性，这为其生物合成途径的定向编辑带来了巨大的挑战。在因生物农药而誉满全球的阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）中，负责阿维菌素（Avermectins）生物合成的PKS模块（Module）7中存在天然失活的脱水酶结构域DH7，而通过氨基酸比对发现，DH7的失活是由于其保守基序H×××G××××P中的H被突变为Y导致的。而这种氨基酸的转变恰好可通过胞嘧啶单碱基编辑实现（将His密码子CAT/CAC突变为Tyr密码子TAT/TAC）。因此，利用eSCBE3-NG-Hypa进行胞嘧啶碱基编辑，在其PKS模块活性结构域DH6、DH8和DH9中，均成功实现了精准的目标氨基酸转变，导致其结构域功能失活，并且在阿维菌素生物合成基因簇中未引入任何脱靶编辑（图6a-c, f），并由此引发了阿维链霉菌中另一个PKS聚酮天然产物寡霉素（Oligomycin） C的高产（图6d, e）。这可能是由于阿维菌素PKS具有高度的底物识别严谨性，其下游结构域作为门控蛋白无法识别结构发生改变的碳链中间体，导致了阿维菌素的合成终止。这进一步造成菌株中的代谢分流，大量的生物合成资源被寡霉素生物合成途径所利用，从而使得寡霉素大量合成。

图6. eSCBE3-NG-Hypa实现PKS结构域的精准失活

基于以上发现，我们利用阿维菌素与其它天然产物生物合成基因簇的竞争关系，通过eSCBE3-NG-Hypa，在阿维菌素工业高产菌的寡霉素或/和菲律宾菌素（Flipins）生物合成基因簇olmA1和pteA1中提前引入终止密码子，获得突变株Δolm、Δpte和ΔolmΔpte（图7a）。结果显示，在实验室500 mL摇瓶发酵条件下，Δolm和Δpte中阿维菌素的产量相比于对照菌株提升了4倍以上。然而出乎想象的是，ΔolmΔpte的产量仅提升了1.39倍，并未出现理想的产量贡献叠加现象（图7b）。为了排除由于碱基编辑脱靶所导致的突变株产量提升，对三种突变株均进行了全基因组测序。结果发现，突变株Δolm、Δpte和ΔolmΔpte中分别含有8、31和 35个DNA单核苷酸变化（Single nucleotide variations, SNVs），但并没有在其它BGCs中意外引入非预期的终止密码子（图7c, d）。

图7 eSCBE3-NG-Hypa在工业菌株中实现阿维菌素的进一步高产

总之，本研究新开发的胞嘧啶单碱基编辑器eSCBE-NG-Hypa具有PAM宽泛性、高效性和高保真性等特点，在链霉菌中的应用潜力巨大。武汉大学药学院博士研究生王建为该论文第一作者，武汉大学药学院孙宇辉教授（现为华中科技大学同济医学院药学院教授）为该论文的通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划合成生物学重点专项（2018YFA0903200）的资助。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-49987-3

遇见/致谢

感谢孙宇辉教授对本公众号的支持！感谢该课题组提供本文稿件支持！

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本期参考文献：https://doi.org/10.1038/s41467-024-49987-3

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