评论区答疑：Western Blot实验内参不齐的原因，附相应解决方案
学术
科学
2024-07-19 07:30
北京
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在上周五的文章《一文读懂Western blot易错点：科研实践中的关键解决方案》中，我们详细梳理了WB实验常见易错点和相应解决方案。然而在实验中，内参不齐的问题也经常困扰着科研人员。内参不齐不仅影响实验结果的准确性，还可能导致实验数据的误读。本文将详细解析内参不齐的原因，并提供相应的解决方案。
（本期文章内容来自以下同学的提问，如果大家有其他问题欢迎写在评论区。）
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在蛋白上样过程中，蛋白质浓度不均或上样量不一致是导致内参不齐的主要原因之一。如果不同样本中的蛋白质浓度差异较大，或者在上样过程中加载量不一致，都会导致内参蛋白的表达量出现差异，进而影响实验结果的可靠性。
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蛋白从胶到膜的转移效率不同，尤其是高分子量蛋白和低分子量蛋白的转移效率差异明显。高分子量蛋白在转膜过程中可能不易完全转移，而低分子量蛋白则可能转移过量，这都会导致内参蛋白信号的不一致。
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尼龙膜和PVDF膜在处理过程中，若洗膜不彻底或封闭不完全，会导致背景噪音增加，从而影响内参蛋白信号的均一性。
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一抗和二抗的反应条件不当，或抗体浓度不合适，均可能导致内参蛋白的检测信号出现不均匀现象。![]()
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样本储存不当或处理过程中蛋白酶活性未被有效抑制，会导致内参蛋白部分降解，影响检测结果。• 在样本加载过程中，使用高质量、精确的移液器以确保每个样本孔中加载的蛋白量一致。• 使用Bradford法、BCA法等可靠的蛋白定量方法（R平方最好0.99以上），对每个样本进行定量测定，确保各样本的蛋白浓度相同。• 在上样之前，根据定量结果调整各样本的浓度，使其达到相同水平。• 在上样过程中，确保每个样本孔中加载的体积一致。常规做法是上样20-30μL，但具体体积可根据实际需求调整。• 根据目标蛋白的分子量选择合适的转膜条件。对于高分子量蛋白（>100 kDa），建议延长转膜时间或提高转膜电压，例如将转膜时间延长至2小时或将电压提高至30V。• 对于低分子量蛋白（<30 kDa），可以缩短转膜时间至30分钟或降低电压至15V，以防止过度转膜。• 常用的转膜缓冲液包括Tris-Glycine缓冲液和转膜缓冲液（如10%甲醇、0.02% SDS）。根据蛋白性质选择合适的转膜缓冲液，确保蛋白的有效转移。• 使用均匀的电场和温度条件进行转膜（注意看冰是否已经融化，必要时进行补冰），避免局部过热或过冷导致转膜效率不均。• 在洗膜过程中，使用适量的洗液（如TBST或PBST），确保彻底去除未结合的抗体和其他杂质。建议每次洗膜时间不少于5分钟，共洗3-5次。• 封闭时，使用优质封闭液（如5%脱脂奶粉、3% BSA），确保封闭时间不少于1小时。严格按照操作说明进行，避免封闭不足或过度。• 在封闭和抗体孵育过程中，确保膜完全浸没在溶液中，避免膜干燥或边缘处理不均匀。• 根据一抗和二抗的说明书，选择合适的抗体浓度和孵育时间。一般来说，一抗的浓度为1:500至1:5000，二抗的浓度为1:2000至1:10000，具体浓度需根据预实验结果调整。• 进行预实验以确定最佳的一抗和二抗浓度，避免过高或过低的抗体浓度导致信号过强或过弱。• 根据抗体的特性，选择适当的孵育时间和温度。一抗通常在4°C孵育过夜，二抗则在室温孵育1小时。• 在样本处理过程中，加入适量的蛋白酶抑制剂（如PMSF、蛋白酶抑制剂混合物），防止蛋白在处理过程中降解。• 蛋白酶抑制剂应确保在样本制备和处理的各个步骤中保持有效。• 样本处理过程中应尽量在4°C或更低的温度下进行，减少蛋白酶活性。• 样本储存时，应尽量在-80°C冷冻保存，避免反复冻融，因为每次冻融都会增加蛋白降解的风险。• 在样本制备过程中，尽量缩短处理时间，避免长时间暴露在常温条件下，减少蛋白降解的可能性。
