海声刀（Histotripsy）:对癌症治疗的免疫学影响

尽管癌症在历史上一直困扰着人类，但仍然迫切需要改进治疗方案。癌症治疗的核心支柱是化疗、手术、放疗、免疫治疗和消融。实体瘤最常见的治疗选择仍然是手术切除，尽管许多患者由于肿瘤大小、位置或疾病进展而不适合 （1-4）。肿瘤消融方式已被开发为微创和无创辅助治疗或手术替代方案。这些手术包括射频消融术 （RFA）、微波消融术、冷冻消融术、不可逆电穿孔术 （IRE）、高强度聚焦超声 （HIFU） 和histotripsy 术。虽然这些手术解决了传统手术的许多问题，但这些方式仍有许多领域可以改进。

虽然肿瘤学研究领域的目标是寻找治愈性疗法，但新型癌症疗法通常针对非治愈性终点，例如增加无进展生存期、增加总生存期、减少肿瘤负荷和改善生活质量。在许多情况下，局部消融治疗的治疗目标还包括减少肿瘤负荷、增强药物向肿瘤的输送以及调节免疫系统。虽然免疫系统调节在患者长期益处方面提供了最大的希望，但它是目前局部肿瘤消融疗法最不可预测和理解的好处。局部肿瘤消融方式最明显和可靠的益处目前被认为是靶向肿瘤大小的减小 （5）。这可以通过减瘤肿瘤来改善患者的预后，从而减少患者的整体肿瘤负荷，改善局部脉管系统压迫，并减少肿瘤营养物质的利用。

鉴于癌症最使人衰弱的方面之一是转移性疾病带来的负担，理想的治疗方案不仅要解决较大或使人衰弱的肿瘤的减瘤问题，还要解决循环肿瘤细胞和远处转移的问题。一旦癌症从其原发部位扩散，单个肿瘤的局灶性减瘤就不太可能成为治愈性治疗选择。因此，理想的减瘤疗法不仅可以缩小目标肿瘤的大小或完全消除目标肿瘤，还可以刺激免疫系统寻找并破坏全身的转移性病变。这种现象被描述为远隔效应 （图 1).越来越多的证据表明，免疫系统激活和全身肿瘤消除对于消除局部治疗肿瘤远端的微转移病灶至关重要，这些病灶在治疗或手术时可能无法检测到。本文简要介绍了非histotripsy 肿瘤消融治疗的免疫反应，以便为更好地了解histotripsy 知识的状态提供背景和参考。以前已经在超出本综述范围的深度对非histotripsy 消融方式的免疫反应进行了更广泛的综述 （6， 7）。

图 1

靶向肿瘤的局部治疗和全身性肿瘤控制的机制。右图显示了远隔效应的原理，其中一种肿瘤的治疗会导致体内的其他肿瘤由于免疫系统的参与而在不同程度上缩小或被消除。左图描述了通过局部治疗实现全身效果的简化机制。DC， 树突状细胞;MHC，主要组织相容性复合物;TCR，T 细胞受体。

在正式定义远隔效应之前，医生在 20 世纪之交首次注意到它thCentury Who 报告说，白血病患者脾脏的局部靶向放疗会导致患者骨髓发生变化，从而导致疾病缓解 （8， 9）。这些临床发现与许多小鼠研究相结合，导致远隔效应在 1950 年代初期被定义为包括施加电离辐射后对远处器官或癌症的影响 （10）。这种影响最初被认为只发生在白血病中，脾脏的辐射会减少或消除体内的癌细胞 （10， 11）。然而，在随后的几十年里，定期出现更多显示这种效果的实体瘤报告。例如，据报道，在放疗单个巨大滤泡性淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤肿瘤后，远处转移的大小减小 （12， 13）。然而，由于报告稀缺，包括肾细胞癌、乳腺癌和神经母细胞瘤在内的实体瘤电离辐射的远隔效应经常被忽视，并且几十年来一直存在争议 （14–17）。时至今日，与放射治疗相关的远隔效应仍然存在争议 （18）。最近，非电离消融疗法的发展导致报告的远隔效应数量增加。热消融术是最早开发并被广泛接受的消融疗法，也报告了全身免疫介导效应的零星病例，其中发现未经治疗的远端转移自发消退 （14， 19， 20）。其中一项早期案例研究表明，用 RFA 治疗原发性肾细胞癌肿瘤会导致肺转移的自发消退 （14）。另一方面，随着越来越多的非热消融方式被开发出来，临床前研究在局灶性消融治疗和全身效应之间有更有希望的相关性 （21-23）。一般来说，尽管这些疗法可以为患者提供全身治疗效果，但应该注意的是，患者、肿瘤类型和治疗方式之间的可重复性并不理想 （6）。

为了达到远隔效应，仅仅释放组织损伤或细胞死亡的非特异性标志物是不够的，如果是这样的话，手术切除会刺激全身效应。相反，需要释放特定的肿瘤相关抗原，使免疫系统能够建立靶向反应（图 1).当聚焦时，局部消融疗法会破坏肿瘤的基质组织，这可以增加免疫细胞物理接触肿瘤的机会 （24， 25）。随着癌细胞被消融，可接近的肿瘤抗原的丰度增加，这些抗原可以通过浸润抗原呈递细胞 （APC） 来识别，例如树突状细胞 （20， 26）。这些 APC 反过来可以激活淋巴细胞以指导更精确的免疫反应。局部，细胞毒性 CD8+ T 细胞的激活可以增加用肿瘤消融方式治疗的区域内任何存活癌细胞的清除率 （27）。为了获得最强的全身免疫效果，消融后，树突状细胞将处理可用的肿瘤相关抗原并迁移到最近的引流淋巴结和脾脏。一旦进入淋巴组织，树突状细胞通过 MHC I 类或 II 类受体将抗原呈递给幼稚的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞，同时 CD28 与 CD80/86 共刺激。研究表明，次级淋巴器官或外周血中肿瘤特异性淋巴细胞的增加也确定了这些活化细胞与肿瘤负荷全身性降低之间的相关性 （28–31）。最近，其他研究还定义了 B 细胞活化、浆细胞的维持，甚至局部肿瘤消融和树突状细胞激活后肿瘤特异性抗体的产生 （29， 31）。例如，一项治疗肝细胞癌 RFA 的研究报告称，与未看到比率增加的患者相比，178 名中性粒细胞与淋巴细胞比值降低的患者中，只有 91 名与生存率显着增加独立相关（32).虽然 T 和 B 淋巴细胞的激活是局部肿瘤消融治疗全身效应的核心特征，但存在许多不一致之处。同样，在一项调查 RFA 治疗继发性肝肿瘤后长期影响的前瞻性研究中，发现研究的 49 名患者中只有 6 名在治疗后数月抗体、CD4+ T 细胞和/或 CD8+ T 细胞增加 （29）。虽然远隔效应和全身抗肿瘤免疫反应的不一致报告背后的确切机制尚未完全定义，但据推测局部肿瘤微环境的变化会显着影响治疗成功。

尽管有许多有希望的临床前和临床研究表明消融疗法对全身免疫反应有积极影响，但也有相反的报道。肝 RFA 和微波消融术都看到了肝细胞癌肿瘤和结直肠转移治疗的临床前报告，刺激现有和新肿瘤的生长 （33， 34）。已经研究了多种假设来解释这种现象。解释这种现象的一个主要假设集中在影响边缘区组织的亚消融性热疗上。调查这种效应的研究表明，该区域的炎症通路上调，包括 IL-6-HGF/c-Met-STAT3-VEGF 轴和 HSP70 相关通路 （35–37）。其中一项研究还表明，当 RFA 以更高的能量剂量在较短的时间内应用于乳腺癌肿瘤的大鼠的健康肝脏以减少对周围组织的损伤时，以及与 HSP 抑制剂联合给药时，这种全身效应会最小 （35）。与应用微创消融术后肿瘤生长增加相关的另一个原因，与炎症反应的变化无关，是可能沿针道发生的种子 （38）。

为了确定全身抗肿瘤免疫的原因，以及如何调节它，需要了解肿瘤微环境中发生的事情。在大多数肿瘤的异质性细胞群中，存在多种肿瘤相关免疫细胞。在理想情况下，这些白细胞正在消除恶性细胞。然而，在许多癌症的情况下，白细胞被重新编程或极化，以支持肿瘤逃逸和通过产生相对免疫抑制的肿瘤微环境来促进肿瘤发生。这些肿瘤通常被称为免疫抑制性或免疫学上“冷”，因为它们缺乏炎症和主动免疫抑制。由于多种类型的促肿瘤免疫细胞会产生可以改善肿瘤生态位的因子，因此促炎/抗肿瘤免疫反应很难克服这种“寒冷”环境。

与这些抗炎和促肿瘤特性最常见的白细胞包括肿瘤相关巨噬细胞 （TAM）、髓源性抑制细胞 （MDSC） 和肿瘤相关中性粒细胞 （TAN） （图 2).TAM 通常定义为 CD45+ Ly6C MHCII CD11b （39， 40）。TAM 也根据 M1 巨噬细胞样表型（促炎/抗肿瘤）CD68、CD80/86、CD11c iNOS 和 M2 巨噬细胞样表型（促肿瘤）CD163、CD204、CD206、Arg1 的极化分为亚群，其中 M2 样 TAM 的免疫抑制性最强 （41， 42）。应该注意的是，虽然 M1 样和 M2 样 TAM 确实具有相似的表达模式和活性，但它们与传统的 M1 和 M2 极化巨噬细胞不同。MDSC 通常定义为人类的 CD45、CD11b、CD11c、MHCII 以及 CD15 和 CD66b （43–45）。MDSCs 分为两种主要亚型：单核细胞 MDSC Ly6C Ly6G 和粒细胞 MDSCs Ly6C Ly6G （43）。在通常搜索 MDSC 时，使用 GR-1 抗体，因为它同时结合 Ly6C 和 Ly6G （43）。TAN 定义为 CD45、CD11b、Ly6G，据报道在人类癌症中表达 CD66 和 CD15 （46–48）。应该注意的是，已为 TAN 建立的标志物与传统的中性粒细胞没有区别，两个细胞组之间最确定的表型差异是中性粒细胞的半衰期为 6-8 小时，而 TAN 的寿命显着延长（额外 12-24 小时），这是由于抑制凋亡途径和肿瘤微环境中细胞因子的支持 （48-52）).与 TAN 的命名类似，TAN 也可分为 N1 促炎亚型和 N2 促肿瘤亚型，但由于标志物的限制，没有区分 N1 和 N2 TAN 的既定面板 （46）。-++++++++++++--+++--++++

图 2

促肿瘤免疫细胞。CD66、CD66b 和 CD15 是人类特异性标志物。Gr-1 代表 Ly6C 和 Ly6G，因此不区分 MDSC 亚型，MDSCs 在 Ly6C+ 时是单核细胞，当 Ly6G+ 时是粒细胞。大多数可用于促肿瘤免疫细胞的标志物是表面受体和配体，此处列出的例外包括细胞内蛋白 Arg1 和转录因子 FOXP3。

这些抗炎白细胞通常分布在整个肿瘤和边缘 （图 2）和功能，而不仅仅是与肿瘤相关。这些白细胞通常被称为促肿瘤细胞，因为它们的活动范围可以积极促进肿瘤生长和发育。这些功能包括减少抗肿瘤免疫应答的影响、募集额外的肿瘤支持细胞、通过刺激血管生成和分泌生长因子帮助肿瘤生长，以及协助上皮到间充质的转变 （53–55）。对于 TAM，这包括产生 IL-10、Arg1 和 TGF-β 等抗炎介质 （56–58），促进检查点抑制剂的表达以抑制 T 细胞 （56， 57），通过 STAT3 的 IL-6 信号转导诱导癌症干细胞增殖 （59），以及产生 VEGF 以刺激血管生成 （60， 61).这些作用也见于 TAN 和 MDSC，它们都已被证明可产生相似的细胞因子、检查点抑制剂和生长因子 （47， 48， 62–64）。

除了这些单核细胞和粒细胞衍生的细胞外，淋巴细胞还可以帮助维持这种“冷”肿瘤微环境。调节性 T 细胞，定义为 CD3、CD4、CD25、FOXP3，可以抑制适应性免疫应答 （65）。虽然 MDSC、TAN 和 TAMs 通常被认为是具有特定标志物和功能的肿瘤促进细胞，但 T 调节细胞的作用更具情境特异性，它们的存在和比率不一定是免疫抑制性肿瘤微环境的标志。在大多数情况下，存在高比例的 T 调节细胞（以抑制其他 T 细胞的功能而闻名）是免疫抑制性肿瘤微环境的标志。临床上，在卵巢癌中，已经确定 T 调节细胞募集到肿瘤基质中会导致患者生存率降低 （66）。此外，对于胰腺癌，已发现 T 调节细胞有助于辅助性 T 细胞 17 驱动的促癌炎症 （67）。患者预后相关性差与 T 调节细胞可通过产生免疫抑制性细胞因子（包括 IL-10 和 TGF-β）来抑制辅助性 T 细胞的功能 （68， 69），分泌穿孔素和颗粒酶直接破坏效应 T 细胞和 B 细胞 （70），并表达检查点抑制剂 CTLA-4 以抑制 APC 活性 （71).还有报道称，T 调节细胞通过 NF-κB-IL6-STAT4 信号转导轴刺激癌症干细胞，直接增加肿瘤的生长 （72）。++++

另一方面，有报道称某些癌症，例如结直肠癌，对于肿瘤内 T 调节细胞较少的患者，这些癌症的预后较差 （73， 74）。结直肠癌中 T 调节细胞看似矛盾的免疫促进功能的拟议机制与这些肿瘤的位置有关。在胃肠道中，T 调节细胞针对肠道空间的微生物群而不是癌症 （74）。免疫系统的这种次要非肿瘤靶标允许免疫反应在结肠中变得更加强大，这反过来可以破坏癌细胞，而不会受到肿瘤微环境免疫抑制控制的阻碍。

冷”和“热”肿瘤微环境之间的最大差异通常被认为与“热”或发炎肿瘤中抗肿瘤、促炎 T 细胞的浸润有关 （75）。检查点抑制剂正在成为用于促进肿瘤微环境从“冷”转变为“热”或免疫活性的主要疗法 （76）。在许多癌症的情况下，检查点抑制途径被劫持，以防止免疫细胞消除不健康或癌细胞。肿瘤消融领域研究最频繁的两种检查点抑制剂通路是 CTLA-4 至 CD80/86，阻断 CD80/86 在 T 细胞活化中的正常共刺激作用，以及 PD-1 至 PDL1/2 （图 3).CTLA-4 是一种检查点抑制剂，最常与淋巴结中的抗原呈递相关，可最大限度地减少 T 细胞的增殖 （76）。在治疗上，当 T 细胞上的 CTLA-4 被靶向抗体阻断时，整体 T 细胞增殖增加，形成肿瘤特异性免疫反应的可能性增加。虽然抗 CTLA-4 用于增加 T 细胞增殖，但 PD-1 抑制剂可减少 T 细胞抑制并改善功能。在正常情况下，PD-1 会抑制 T 细胞的活性，并阻止 T 淋巴细胞靶向健康宿主细胞 （76）。健康组织中的这条通路可以防止可能驱动自身免疫的过度免疫反应。然而，一些肿瘤细胞劫持了这种机制并增加了 PD-1 配体 （PD-L1/2） 的表达，从而人为地降低了肿瘤微环境中抗肿瘤 T 细胞的活性。使用靶向 PD-1 通路的抗体进行癌症治疗表明，在表达 PD-L1/2 表面受体的肿瘤中，浸润 T 细胞水平增加。虽然与基于 CTLA-4 的疗法相比，PD-1 通路抑制具有更针对肿瘤特异性的治疗效果，并且通常副作用更少，但仍需要改进检查点抑制策略的实施。在免疫学上“冷”肿瘤中尤其如此，这些肿瘤在不使用 PD-1 或 CTLA-4 通路的情况下实现了免疫抑制，这些检查点靶向疗法已被证明效果微乎其微。不幸的是，即使在这些疗法有效的情况下，也经常会出现明显的副作用。例如，T 细胞丰度的全身性增加通常会导致自身免疫性疾病样症状，如疲劳、恶心、呕吐、腹泻、关节炎、皮炎和肌痛 （77）。

图 3检查点抑制剂的作用。抗原呈递细胞 （APC）。

除了肿瘤微环境中的生化变化会破坏免疫系统的检测和消除之外，还存在可能对治疗方法产生重大不利影响的物理屏障。事实上，许多肿瘤采用器官样结构和广泛的纤维化，从而构建了高度复杂的物理屏障 （78， 79）。鉴于检查点抑制剂的机制是改善免疫系统激活和靶向杀死肿瘤细胞，因此白细胞能够物理接触恶性细胞至关重要。为了帮助检查点抑制剂疗法，消融方式已被广泛研究，以更好地了解它们调节肿瘤微环境免疫方面的能力。虽然减瘤肿瘤和减轻患者的整体肿瘤负荷是局灶性肿瘤消融治疗的主要目标，但改善免疫系统可及性被证明是一个额外的好处，可以将局部 TME 从“冷”和免疫抑制转变为更“热”和免疫刺激。

在治疗后的几周和几个月内，具有热效应的消融疗法在肿瘤微环境中零星地出现促炎变化 （80–83）。然而，就免疫调节成功而言，非热模式似乎具有更高的可重复性、可预测性，并提高了临床前和临床成功率 （21， 84–86）。关于模式之间差异的主要假设理论上，虽然热消融和非热消融方法都会杀死肿瘤细胞，但非热消融方式会释放更高水平的天然肿瘤特异性抗原，这些抗原尚未被热扭曲或变性。例如，一项体外研究表明，与热消融相比，用冷冻消融和 IRE 处理的细胞释放的完整新抗原的量级明显更高。不仅释放了更多的肿瘤抗原，而且这些抗原在刺激树突状细胞抗原呈递和细胞毒性 CD8+ T 细胞激活方面也更有效 （87）。激活的淋巴细胞，无论是对肿瘤特异性抗原的反应，还是更普遍地对损伤相关分子模式 （DAMP） 增加驱动的先天免疫系统激活的反应，进一步促进了从“冷”到“热”肿瘤微环境的转变 （21， 88， 89）。因此，越来越清楚的是，非热消融方式能够诱导强大的局部和全身抗肿瘤反应，作为免疫疗法的独立或辅助治疗，除了局灶性肿瘤减瘤之外，它还具有重要的前景。

histotripsy 术是一种非热聚焦超声疗法，它利用微秒（空化-云组织碎裂术，CCH）或毫秒（沸腾组织碎裂术，BH）脉冲方案来产生空化气泡云，从而导致精确的非热肿瘤消融（图 4) (除了histotripsy 术外，其他诱导空化且不会引起实质性热效应的非热聚焦超声方法被广泛称为机械 HIFU （mHIFU），而不是通常指热消融的传统 HIFU。出于本研究的目的，热 HIFU 将被称为 tHIFU 以与 mHIFU 程序区分开来，这将是本综述的重点。

图 4

histotripsy 术示意图。位于体外的治疗性超声换能器将超声波聚焦在目标组织内，产生空化气泡云。

在组织碎裂术中，空化气泡的快速膨胀和崩溃将组织消融成无细胞碎片 （91–94）。这种非热消融过程是公认的，并导致了组织碎裂术的重要标志，包括高精度和组织选择性 （95–97）。例如，具有较高杨氏模量的组织，如脉管系统和集合管，更耐损伤 （98-105）。与绝大多数其他消融疗法不同，由于histotripsy 术是非热的，因此它不受散热器效应的影响，因此在脉管系统附近使用仍然安全有效 （106， 107）。histotripsy 术的其他好处包括使用标准成像（超声、MRI、CT）进行实时成像反馈、高精度毫米级精度以及治疗任意大小和形状的肿瘤的能力 （100， 108）。治疗后，与其他消融方式相比，用histotripsy 处理的组织显示出消融组织的溶解更快 （92， 108）。例如，健康大鼠肝脏的 CCH 消融显示治疗体积在 28 天内快速退化、肉芽化和健康肝细胞生长，疤痕最小 （92）。这种愈合过程比其他消融方式报道的更快，例如人类的 RFA，据报道它会导致“热固定”，其中坏死肿块在治疗后 14 个月仍然存在，因为组织的热变性使其抵抗被正常途径分解 （109）。

在小鼠模型中，肝、肾、神经母细胞瘤、黑色素瘤和胰腺肿瘤的histotripsy 消融术导致生存率显著提高 （22， 110–113）。除了减瘤肿瘤外，最近的证据表明，histotripsy 术还具有诱导全身免疫反应的能力，联合免疫疗法减轻转移和改善局部和远处疾病证明了这一点 （22， 114， 115）。这种效果已在单一肿瘤治疗中得到证实，并且在单独的未治疗肿瘤中也显示出对侧肿瘤生长的横隔样减少 （22， 112， 115）。发现这种影响是适度的，但与接受照射和射频消融治疗的小鼠的不显著趋势相比，histotripsy 术消融具有统计学意义 （22）。histotripsy 术引起的分子免疫学效应，独立并与其他消融方式相比，可以最好地总结为拟议的机制，如下所示图 5这将在下面的部分中描述。

图 5histotripsy术在免疫系统调节中的假设作用示意图。机械消融后已被证明受聚焦超声治疗调节的免疫过程、细胞和分子根据免疫系统功能进行了总结：促肿瘤免疫细胞、细胞免疫和全身免疫。

由于对靶组织的影响相当，因此通过空化对组织切开术消融的免疫反应，无论应用何种亚疗法，理论上都是相似的。空化分解组织，将细胞消融成亚细胞片段和脱细胞碎片 （116）。迄今为止，尚无研究表明 mHIFU、BH 和 CCH 在免疫反应方面存在任何显著差异。因此，在本综述中，将一起回顾对这些方式的免疫反应。

能够降低肿瘤微环境中存在的肿瘤支持免疫细胞的大小是相关的，因为这些细胞与较差的结果相关 （54， 117， 118）。关于热消融和非热消融方式的多项研究表明，该疗法直接消除了支持肿瘤微环境的细胞，或者消融引发的损伤对肿瘤微环境中的白细胞进行了重编程，使微环境转变为对肿瘤进展更苛刻的环境 （6， 7）。

在组织碎架分析的情况下，Pahk 等人有一份报告证明，体外用 BH 处理的细胞的上清液将幼稚巨噬细胞 （M0） 极化为抗肿瘤巨噬细胞 （M1），并且肿瘤相关巨噬细胞（M2 样表型）再分化为更具炎性的 M1 表型 （119）。在本研究中，乳腺癌细胞在体外用不同剂量的 BH 处理并收集上清液。分析发现，包括 TNF 在内的促炎信号分子增加，TNF 是一种有效且成熟的 M1 刺激细胞因子 （120， 121）。用 BH 上清液培养 THP-1 人单核细胞后，它们表现出与 M1 巨噬细胞极化一致的物理和形态变化，并显示与 M1 极化一致的基因表达显著升高 （119）。总之，本研究中提供的数据表明，histotripsy 术消融区附近的单核细胞和巨噬细胞极化为促炎、抗肿瘤表型。同样，Pahk 等人继续进行体外研究表明，BH 上清液还可以刺激 M2 细胞复极为 M1，从而导致 M2 促肿瘤巨噬细胞减少。图 5).因此，这些数据进一步表明，任何留在治疗区内的肿瘤相关巨噬细胞都有可能从 M2 样状态复极化为 M1，类似于治疗边缘的细胞。如果这可以在体内概括，这将有助于进一步减少促肿瘤免疫细胞的存在，并可能显着改变肿瘤微环境从“冷”到“热”的转变。

关于体内研究，似乎可以安全地假设治疗区肿瘤微环境中的促肿瘤细胞会由于组织异位术的亚细胞分馏而被消融。这一具体假设尚未得到文献的证实，任何在部分消融后存活下来的细胞仍存在增殖和维持促肿瘤肿瘤微环境的窗口。然而，这一假设与 RFA、微波消融和 IRE 的结果一致，它们都可以减少肿瘤微环境中肿瘤支持免疫细胞的存在 （7， 122）。这种动态在人类患者中也可见。例如，对接受 IRE 治疗的胰腺癌患者的研究发现，在治疗后的几天内，外周血中的 T 调节细胞减少 （85， 86）。另一项针对接受 RFA 治疗的原发性肝肿瘤患者的研究表明，MDSC 的减少与患者生存率的增加之间存在很强的相关性 （123）。促肿瘤免疫细胞衰减的重要性、其功能下降和消融后幅度的降低通常都与人类患者生存率的降低相关。因此，histotripsy 学领域进一步了解消融对免疫调节机制这一方面的影响非常重要。

histotripsy 术通过机械分级分离产生靶细胞的亚细胞片段 （116）。这反过来又会释放出多种损伤相关分子模式 （DAMP），这些分子模式有可能刺激先天免疫系统并显着改变肿瘤微环境。DAMP 是在大多数形式的病理性细胞死亡后在细胞外发现的分子。这些分子很容易被免疫系统识别，进而引起强大的先天免疫反应。在肿瘤消融的背景下已经观察到和评估了几种 DAMP，包括内质网相关蛋白钙网蛋白 （CRT）、非组蛋白核结合蛋白 HMGB1、细胞内能量分子腺苷 5'-三磷酸 （ATP） 和各种热休克蛋白 （HSP），这些蛋白最初被鉴定为暴露于高温后释放的 DAMP （124-128).一旦从受损细胞或损伤后的邻近细胞中释放出来，这些分子就可以通过与称为模式识别受体的受体结合来刺激强大的免疫反应。例如，HMGB1 通常激活 Toll 样受体 2 和 4，它们通常通过 NF-κB 发出信号，以驱动多种生物反应，包括炎症和细胞死亡 （129）。

这些 DAMP 正在成为histotripsy 术后随后免疫反应的关键介质。具体而言，在癌症球体组织切碎术处理后，在细胞上清液中鉴定出 HMGB1、CRT 和 HSP，并与体内消融后肿瘤内的预期水平相关 （119）。此外，已发现用histotripsy 术治疗的小鼠肿瘤内 HMGB1、CRT 和 HSP 水平升高，并且治疗后血清中经常发现 HMGB1 升高 （22， 110， 130）。血清中释放的 DAMP 起到全身启动免疫系统的作用，并且可以募集增加的循环白细胞，这些白细胞最终可以在消融后聚集在组织损伤部位。总之，DAMP 的局部和全身存在有助于额外的免疫细胞迁移，改变肿瘤微环境，并最终可能成为消融成功的有效生物标志物。

虽然在histotripsy 术后已证实 DAMP 释放，但确定这些信号是否处于初始且未改变的结构构型中也很重要。对于热消融方式，已经确定蛋白质可以在高温设置下变性，这使得它们在刺激免疫系统方面的有效性和可预测性降低。一项研究调查了 mHIFU 和 tHIFU 之间 ATP 和 hsp60 释放的差异 （130）。这项研究发现，mHIFU 在处理后能够释放更高水平的两种分子，并且 mHIFU 释放的 DAMP 更能刺激下游免疫变化，例如激活树突状细胞 （130）。与 tHIFU 相比，mHIFU 能够释放更高强度的活性 DAMP，这增加了非热消融疗法与热方式相比更具免疫调节性的假设。

这些数据表明，histotripsy 术疗法能够释放可以驱动抗肿瘤免疫系统激活的分子，例如通过启动强大的先天免疫反应。然而，与histotripsy 术后释放的特定 DAMP 相关的数据在研究中并不一致。例如，最近一项关于用 mHIFU 治疗的皮下小鼠神经母细胞瘤的研究显示，HMGB1 水平没有显着变化 （112）。这可能是由于肿瘤类型的差异。例如，神经母细胞瘤在histotripsy 术后没有看到 DAMP 的变化，这在其他地方报道的结肠腺癌、肾细胞癌和乳腺癌中观察到 （22， 110， 112， 130）。或者，histotripsy 术和其他 mHIFU 消融方式存在潜在差异，这些差异尚不完全清楚，可能已经发挥作用。另一种可能性是部分消融与更完全治疗之间 DAMP 释放的差异是造成这些差异的原因。所有这些变量都可能影响释放的 DAMP 的质量和数量。同样，根据许多实验因素，生成的实际 DAMP 可能会有很大差异。尽管上述 DAMP 是目前histotripsy 术后最明确的，但可以想象，任何 DAMP 都可以在消融后作为先天免疫系统的激活剂发挥作用。未来对其他 DAMPs（如核和线粒体 DNA、活性氧和钙离子）影响的研究可能有助于改进辅助治疗 （131）。需要更多的研究来确定不同机械聚焦超声疗法释放 DAMP 的数量和质量的任何潜在差异。

细胞因子和趋化因子对于损伤后的细胞间通讯和免疫系统调节至关重要。图 5).这些分子刺激局部免疫细胞的分化和激活，并系统性地将其他细胞募集到损伤部位。在多次组织切片研究中发现显著改变的关键细胞因子之一是 IFNγ （22， 112， 115， 119）。在乳腺癌的体外研究和神经母细胞瘤的体内小鼠研究中，histotripsy 术后 IFNγ 增加了约 2 倍 （112， 119）。然而，在一项用histotripsy 术治疗 Eker 大鼠肾细胞癌肿瘤的体内研究中，治疗肾脏的肾脏显著降低了 ~6pg/mL，降至 ~2pg/mL （115）。这种减少归因于天然肾组织防止急性和慢性肾损伤的防御机制 （132）。IFNγ 变化的重要性体现在激活抗肿瘤 APC 和效应细胞中的作用，通过作用于内皮细胞诱导肿瘤内部缺血，从而降低瘤内脉管系统的稳定性，并通过激活细胞凋亡和坏死性凋亡通路启动肿瘤细胞死亡 （133）。然而，IFNγ 在肿瘤微环境中也是一把双刃剑。除了作为有效的促炎介质的功能外，IFNγ 还可以作为 IRF1 轴的一部分，在某些肿瘤中上调 PD-L1，从而导致免疫逃避 （134）。

虽然 IFNγ 是跨疗法和肿瘤类型报道最一致的炎症介质，但据报道，其他重要的细胞因子在histotripsy 治疗后几天内显著或显著上调，包括 IL-6、IL-2、TNF、IL-8、IL-13 和 IL-10 （22， 110， 112， 119）。虽然需要更多的研究来更准确地确定机械消融后特定肿瘤类型中细胞因子的状态，但总体情况似乎是积极的。然而，据报道，血清中高水平的 IL-6、IL-10 和 IL-8 与胰腺癌患者的生存率呈负相关，因为它们在刺激炎症和肿瘤微环境的不良变化中发挥作用，从而刺激胰腺肿瘤的生长和发展 （135， 136）。尽管这可能与对histotripsy 疗法的不祥警告有关，但至少对于胰腺应用，这些通路的诱导实际上与小鼠抗肿瘤免疫反应的改善和存活率的增加有关 （22）。当然，这些结果可能只是反映了小鼠和人类之间普遍推广的差异。然而，也可能需要额外的机制见解才能更好地将啮齿动物的研究结果转化为人类患者。

除了释放的细胞因子外，多种生长因子的血清水平也会发生变化。例如，在神经母细胞瘤的 mHIFU 消融后，在治疗后 24 小时内发现 GM-CSF 增加和 VEGF 减少 （112）。GM-CSF 水平升高与 APC 细胞分化和活化增加呈正相关。由于影响肿瘤生长和免疫抑制作用的血管化速率，VEGF 水平降低与较好的临床结果呈正相关 （137）。histotripsy 术可以增加 GM-CSF 和降低 VEGF 的发现增加了histotripsy 术将促进肿瘤的免疫微环境转变为更具促炎性和肿瘤抑制性的微环境的可能性。

随着 DAMP 和抗肿瘤介质释放的增加，肿瘤内免疫细胞群发生了变化。为了响应损伤，与先天免疫相关的细胞被招募得最迅速。对于histotripsy 消融术，据报道包括中性粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和巨噬细胞（图 5).在体外实验中，mHIFU 处理的小鼠结肠腺癌细胞的上清液被证明可以激活巨噬细胞 （130）。这种巨噬细胞激活是通过巨噬细胞释放 TNF 建立的，与 tHIFU 和对照组相比，mHIFU 后 TNF 的激活显著增加 （130）。此外，用 CCH 对黑色素瘤肿瘤进行体内治疗后，治疗 10 天后中性粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和巨噬细胞增加 （22）。瘤内免疫细胞群的增加表明肿瘤微环境变得更具免疫刺激性，并且这些细胞群通常与肿瘤微环境中的促炎和抗肿瘤变化相关。

除了先天免疫细胞，消融后适应性免疫细胞的调节也与临床成功密切相关 （6， 7）。在同一项黑色素瘤 CCH 消融研究中，在治疗后 10 天观察到治疗肿瘤内 T 辅助细胞和 B 细胞的增加 （22）。除了这些适应性免疫细胞群的增加外，该研究还发现瘤内 T 调节细胞减少 （22）。辅助性 T 细胞和 B 细胞的增加进一步表明 TME 已转变为更允许的促炎环境，并进一步说明了这些细胞对肿瘤的可及性有所改善。一般来说，白细胞的流入似乎反映了先天免疫系统的早期诱导，并最终在治疗后的几周内产生与强大的适应性免疫反应相关的细胞。总之，预计这些变化将对转移病灶的局部和全身影响产生重大影响。然而，重要的是要注意，虽然这些促炎免疫细胞在残留治疗肿瘤中的存在增加确实暗示了更强、更稳健的整体免疫反应，但这些细胞必须专门针对在循环或次级淋巴器官中发现的肿瘤抗原做好准备，以有效控制整体疾病负担。

改善适应性免疫系统的参与并增加全身抗肿瘤免疫反应

全身抗肿瘤免疫反应的启动需要产生高数量和高质量的肿瘤抗原。先前对热消融、冷冻消融和 IRE 的研究确定，非热消融方式似乎会释放抗原，这些抗原在驱动可预测和有效的抗原呈递方面明显更好 （87）。这最终导致全身免疫反应的改善 （87）。尽管尚未明确的研究探讨组织切碎术消融是否会对释放抗原的质量产生负面影响，但已经进行了间接评估这种机制的研究。一项使用 B16F10 小鼠黑色素瘤细胞系和细胞系转基因变体的研究显示，组织裂开术在表达免疫原性活性抗原的肿瘤中的免疫调节作用增加 （22）。在这项研究中，只有肿瘤转染了潜在抗原 GP33（一种来自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的已知抗原）并接受组织整理术治疗的小鼠，才产生了能够在 IL-2 和布雷菲德菌素 A 刺激后产生 IFNγ 的 CD8+ T 细胞。这两种药物刺激记忆 CD8+ T 细胞。总之，这些数据表明，转染的抗原在组织切开术治疗后仍然有效，并且能够刺激适应性免疫反应。

树突状细胞的激活和迁移到肿瘤引流淋巴结和脾脏是全身免疫系统激活的进一步证据。对树突状细胞的早期研究发现，从体外 mHIFU 处理中收集的上清液能够刺激未成熟的树突状细胞表达更高水平的 CD80 和 CD86，这是激活的标志物，并增强 IL-12 的分泌，树突状细胞利用 IL-12 激活 CD8+ 细胞毒性和 CD4+ 辅助性 T 细胞 （130， 138， 139）。对各种肿瘤类型的其他小鼠研究进一步确定了树突状细胞向肿瘤引流淋巴结和脾脏的迁移或增加 （112， 140， 141）。这种关键抗原呈递细胞的较高存在表明随后淋巴细胞群可能会增加。

一旦 APC 被激活，抗原就会呈递给 CD8+ 和 CD4+ T 细胞，这些细胞增殖并随后被募集回治疗过的肿瘤，并在全身循环中靶向并杀死表达靶向肿瘤特异性抗原的远端肿瘤细胞。如前所述，T 调节细胞的减少对于改变肿瘤微环境和将免疫反应从“冷”转变为“热”非常重要，从而使这些抗肿瘤 CD4+ 和 CD8+ T 细胞能够进入恶性细胞。histotripsy 术已被证明可以降低 T 调节细胞的大小，并增加治疗小鼠的肿瘤引流淋巴结和脾脏中 CD8+ 与 T 调节细胞的比率 （22， 141）。例如，在用 CCH 治疗黑色素瘤肿瘤后，发现脾脏中 CD8 + ：CD4 + 细胞的比率增加 （22）。此外，用 mHIFU 治疗前列腺肿瘤后，还发现脾脏中 CD8 + ：CD4 + 细胞的比率增加，并保护细胞免受后续的肿瘤攻击 （141）。然而，在用 mHIFU 治疗神经母细胞瘤肿瘤时，发现脾脏中 CD8 + ：CD4 + 细胞的比率降低 （112）。CD8 + ：CD4 + 比值增加与减少的这种差异并不一定表明调节性 T 细胞占主导地位，也不表明预后不良。这种比率的变化可能表明辅助性 T 细胞准备好增加免疫反应，以应对可能导致免疫刺激反应的损伤。除了调节性 T 细胞外，已发现histotripsy 术可增加脾脏中 CD8+ 和 CD4+ 辅助细胞的数量 （22， 112， 142）。histotripsy 术治疗后次级淋巴器官中 T 细胞群的这些变化意味着肿瘤内也发生了类似的变化，并且这些细胞针对肿瘤特异性抗原进行了准备。

虽然所有这些研究都确定了组织切开术治疗后 T 细胞的相关变化，但确定程序性细胞的疗效和肿瘤特异性很重要。将 mHIFU 处理后 10 天从皮下结肠腺癌肿瘤小鼠脾脏中分离的 CD8 + 细胞与相应的细胞系共培养 （140）。发现 CD8 + T 细胞与从用 tHIFU 处理的小鼠中分离的淋巴细胞相比，对癌细胞的细胞毒性更大。在同一项研究中，ELIspot 检测显示，mHIFU 产生的肿瘤特异性 CD8+ 细胞数量高于 tHIFU （140）。在一项针对histotripsy 术治疗的前列腺肿瘤的类似研究中，发现从脾脏收获的 CD8+ T 细胞具有肿瘤特异性，随后在体外与肿瘤细胞攻击时被激活 （141）。最后，在第三项研究中，在肿瘤植入前将已知抗原处理到细胞系中，可以测定肿瘤引流淋巴结中的 CD8+ T 细胞，这些细胞在用 CCH 处理后针对肿瘤特异性抗原引发 （22）。总之，这些研究支持了这样一个假设，即局部肿瘤的组织切开术治疗可有效产生肿瘤特异性 CD8+ 细胞毒性 T 细胞，这些细胞在远端淋巴结和脾脏中全身发现。

适应性免疫系统激活的功效通过全身性肿瘤杀伤来显示，既能减少转移，又能控制对侧肿瘤。一些研究评估了这种现象。例如，在一项使用免疫功能正常的新西兰白兔在单个肾脏内生长的 VX-2 （leporine瘤） 肿瘤的研究中，第 13 天的histotripsy 术治疗在第 19 天时没有显示转移变化 （143）。最终，作者将缺乏差异与癌症的侵袭性联系起来 （143）。除了这项研究之外，应该注意的是，大多数histotripsy 研究实际上已经显示出转移的显着改善 （22， 142）。例如，在小鼠黑色素瘤模型中，肿瘤皮下生长，进行组织碎裂术治疗，并在治疗后两天截肢 （142）。对于迄今为止进行的大多数研究，肺转移的减少与全身癌症控制相关，并提示远隔反应。然而，作为对数据的另一种解释，转移的减少可能只是原发性肿瘤消融由于其尺寸减小而无法产生尽可能多的循环肿瘤细胞的影响。这是对报告转移负荷变化的局灶性肿瘤消融研究的常见批评。

根据该领域的当前数据，我们认为这两种解释很可能都是准确的;因此，转移的减少是由于全身抗肿瘤免疫反应的激活和原发肿瘤的减瘤。因此，未来的机械工作在现场设计实验中旨在更好地建立因果关系是必不可少的。例如，除了通过减少转移来防止额外的肿瘤生长外，对侧肿瘤中还有多篇关于 CD8+ 细胞毒性 T 细胞的报道 （22， 115）。为了评估这些对侧模型中的组织切开术，小鼠接种双侧皮下B16GP33黑色素瘤，并在肿瘤生长 10 天后治疗其中一种肿瘤。在接受治疗的肿瘤中，CD8+ T 细胞急剧浸润，位于消融边缘，而在一周内，未治疗的对侧肿瘤 CD8+ T 细胞缓慢灌注增加 （22）。本研究确定，在注射的相同肿瘤中，可以达到全身效应。作为对侧肿瘤的新头模型，已经部署了 Eker 大鼠。Eker 大鼠是一种插入人结节性硬化症基因 （TSC2） 大鼠同源物的模型，其整个肾脏自发发展为多发性肾细胞癌肿瘤 （144）。在一项沸腾histotripsy 术的研究中，Eker 大鼠有一个大约 0.5 厘米3肿瘤治疗 48 小时后，收集治疗肾和对侧肾用于 CD8 + 细胞免疫组化染色。结果发现，如果治疗一个肿瘤，那么两个肿瘤缠身的肾脏都会看到 CD8+ T 细胞的流入，而假治疗的大鼠则没有看到任何一个肾脏的变化 （115）。据报道，这些对侧肿瘤在靶向原发肿瘤的histotripsy 治疗后生长速率降低，并且比放射消融或 RFA 更显着 （22）。使用肿瘤B16GP33小鼠，肿瘤生长 10 天后，小鼠接受histotripsy 术、RFA、放射治疗或假对照治疗。这项研究发现，与 RFA 和放射消融术相比，接受histotripsy 术治疗的小鼠在治疗肿瘤中发现肿瘤浸润 CD8+ T 细胞的比例显著增加，而假对照均未看到任何增加 （22）。这不仅进一步强化了histotripsy 术可以刺激全身免疫反应的观点，而且还支持非热和非电离疗法更有效的观点。

虽然这些研究中转移有所减少，但更成熟的对侧肿瘤只会减慢其生长，而不会受到抑制或逆转。这意味着，虽然存在针对癌症的全身免疫反应，但不与其他治疗方法或其他治疗相结合，它不足以阻止生长或治愈。此外，mHIFU 治疗产生全身性肿瘤特异性保护的疗效已显示，治疗后 6 天注射的攻击性肿瘤的肿瘤生长速率降低 （140）。值得注意的是，mHIFU 最小化治疗肿瘤生长速率的效果比 tHIFU 更有效，尽管对原发肿瘤的减瘤要大得多（肿瘤体积分别减少 83% 和 43%）（140）。这表明非热消融方式刺激了更强的免疫反应。然而，与先前存在的对侧肿瘤一样，治疗后的注射激发仍然允许肿瘤生长。这些研究共同揭示了histotripsy 术能够通过控制自然发生的转移、自发性相似原发性肿瘤和作为挑战注射的继发性肿瘤来充分启动小鼠免疫系统以减轻全身肿瘤负荷。

鉴于许多癌症对检查点抑制剂具有免疫抵抗力，部分原因是肿瘤微环境的免疫状态，因此探索histotripsy 术作为提高肿瘤反应性策略的潜力至关重要。上面讨论的 DAMP 释放增加、肿瘤微环境炎症状态的转变、肿瘤内免疫细胞募集的增强以及全身抗肿瘤免疫反应的证据都表明，histotripsy 术可以具有可能有利于这些类别的疗法的局部和全身免疫调节作用。基于这些变化，可以合理地假设肿瘤微环境向“热”环境的转变应该会增加检查点抑制剂的作用，从而产生可能更强的抗肿瘤免疫反应。抗 CTLA-4、抗 PD-1 和抗 PD-L1 疗法的疗效与患者肿瘤细胞、APC 和 T 细胞中 CTLA-4、CD80/86、PD-1 和 PD-L1 的表达水平相关。图 3).因此，在研究特定检查点抑制剂的作用之前，确定是否有支持数据表明histotripsy 术可能具有协同作用至关重要 （76）。例如，抗 PD-L1 靶向治疗通常不用于肿瘤不表达高水平 PD-L1 的病例。然而，这并不总是一个明确的决定，尤其是对于治疗后可能诱导或上调的检查点抑制剂。以树突状细胞上 CD80/86 的表达为例，发现当受到 mHIFU 上清液刺激时，CD80/86 在体外增加，表明histotripsy 处理后细胞释放的裂解物可以刺激检查点抑制剂的上调 （130）。在体内，CD86 在脾脏中发现的树突状细胞上显著增加，CD80 在脾脏和肿瘤引流淋巴结中的树突状细胞上显著增加 （141）。研究还显示，mHIFU 治疗后 72 小时肿瘤中 PD-L1 增加 （112）。如上所述，这可能是由于处理后 IFNγ 产生的下游效应。虽然这通常对全身免疫反应有害，但histotripsy 治疗后检查点分子的体内上调表明，利用检查点抑制剂进行协同治疗以潜在提高抗肿瘤免疫力的机会窗口可能增加。

多项研究表明，histotripsy 消融术可以增加 CTLA-4 和 PD-1 通路受体的表达，因此可以合理地假设histotripsy 术联合检查点抑制剂治疗应该具有协同作用。这在最近的两项研究中已经进行了探讨。在一项研究中，个体 CTLA-4 抗体治疗和 CCH 消融降低了对侧肿瘤的生长速度，但在黑色素瘤和肝细胞癌中，联合治疗降低幅度更大 （22）。在这项研究中，一组患有皮下B16GP33黑色素瘤肿瘤的小鼠在histotripsy 术前给予两剂 CTLA-4 单克隆抗体，之后再给予一次治疗。另一组携带皮下 Hepa1-6 肝细胞癌肿瘤的小鼠在histotripsy 术治疗前和组织分离术后给予 3 剂 CTLA-4 单克隆抗体。对于黑色素瘤和肝细胞癌这两项肿瘤研究，与任何一种单独治疗相比，CTLA-4 和histotripsy 术的组合导致肿瘤体积显着减少 （22）。在第二项研究中，与其他治疗组合相比，在 mHIFU 治疗皮下神经母细胞瘤肿瘤后的几天内，三剂 CTLA-4 和 PD-L1 抗体显着提高了动物的存活率 （112）。这项研究更进一步并进行了类似的实验，但不仅关注单个 mHIFU 治疗肿瘤的效果，还观察了第二个肿瘤在对侧生长。在本报告中，在用 mHIFU 和全身 CTLA-4 和 PD-L1 治疗单侧治疗后，两种肿瘤都完全缓解，这种效果在任何其他治疗组合中都没有看到 （112）。总之，这些研究证明了在小鼠模型中，联合疗法优于histotripsy 或检查点抑制剂的治疗效果。

随着过去十年histotripsy 疗法的发展，关于免疫反应的知识已经开始更全面地了解从 DAMP 和抗肿瘤介质释放到局部细胞免疫群体的变化、全身免疫反应的发展以及与检查点抑制剂疗法的治疗协同作用的假设作用。图 5).总之，这些研究表明，在小鼠模型中，组织切片模式产生了可重复的、甚至可能可调的免疫效应，这种效应在多种肿瘤类型中是一致的。然而，虽然这些数据肯定令人兴奋，但该领域的研究数量仍然相当有限，并且大多数基于肿瘤消融质量不一致的小鼠模型。展望未来，需要努力比较各种histotripsy 治疗和剂量，以及其他 mHIFU 方法，以便更好地了解消融程度在刺激免疫反应中之间的关系。同样，随着这些疗法开始用于人体试验，将这些发现转化为与人类患者相关的可操作结果也至关重要。还需要额外的基础研究和临床前动物试验来开发缺失的机制见解，并且需要更多与转化相关的研究，以确保这些发现发生在典型的模式生物之外。尽管存在这些局限性，但在临床前工作中，histotripsy 术优于其他热消融方式的优势表明，这种局灶性肿瘤消融疗法具有诱导全身抗肿瘤免疫反应的潜力，因此支持histotripsy 术有可能对癌症患者的临床结果产生积极影响的假设。