HIFU 病变的组织学特征

高强度聚焦超声 (HIFU) 或聚焦超声手术 (FUS) 治疗软组织肿瘤依赖于产生紧密聚焦的超声场，其中焦点处的强度足以引起不可逆的细胞损伤。主要的生物损伤机制是加热[引文1 ]。目前对细胞水平热损伤的大部分理解都源自体外和全身高温研究。一般来说，温度每升高一度高于 43°C，达到给定细胞损伤水平所需的时间就会减少一半。引文2 ]。局部热疗的效果取决于所达到的温度、散热速率以及组织的特定热敏感性。引文3 ]。总能量吸收由组织的吸声系数、原位强度和暴露时间决定。从热生物学中可知，当细胞被加热到 56°C 至少 1 s 或相当于该温度的热时，蛋白质就会发生变性。引文1 ]。这会导致组织凝固性坏死[引文4 ]。

空化的机械效应也可能造成损坏。超声波通过组织传播的稀薄阶段发生的负压会导致气体和/或蒸汽填充气泡的形成和/或活动，这一过程称为声空化。引文5 ]。当此类气泡围绕其平衡半径（通常为几微米，具体取决于驱动频率）稳定振荡时，就会发生非惯性（稳定）空化。或者，气泡可以增长到其平衡半径的许多倍，然后剧烈破裂。这称为惯性空化。 HIFU 场内空化的第二种机制来自细胞内和细胞外水的超声波 (US) 加热。这种通过气体蒸气的外溶而发生的热诱导气泡活动通常称为“沸腾”。引文6-8 ]。这与内在组织解剖不同，后者诱发的生物效应是由于气泡云的剧烈振荡和崩溃造成的。

已使用两种类型的技术来监测空化活动。主动空化检测（ACD）涉及检测气泡的能量反向散射[引文9–12 ] 或暴露期间超声换能器电阻抗的测量[引文13 ]。后一种方法通常采用阻抗电桥来监测由于气泡反向散射而导致的换能器负载变化。声空化（惯性和非惯性）和沸腾气泡都可以散射超声波。引文14 ]。另一种技术通过监测驱动电压和电流来确定传感器阻抗[引文8 ]。被动空化检测（PCD）涉及检测主动气泡产生的声发射[引文15-19 ]。在压力场中振荡的气泡发出特征声信号[引文20 ]。宽带发射通常被视为惯性空化的独特指标。超谐波发射与非惯性空化的非线性稳定振荡特性相关。引文[10 ]，但也是由于较大的“沸腾”气泡或较小的声空化气泡簇对非线性传播的美国波的高频分量的散射造成的。次谐波和超谐波发射通常与非惯性气泡振荡有关[引文21、引文22 ]。因此，可以通过检测不同的声发射来区分非惯性空化和惯性空化。最后，在离体组织中，细胞内或细胞外的水“沸腾”可以在 HIFU 暴露期间产生可闻的（1-10 kHz）发射，可以听到清晰的“爆裂声”（有时称为“爆裂声”）。作为“爆米花”）[引文8 ]。

据报道，正常肝组织和荷瘤肝组织在不同的 HIFU 暴露后肝脏发生组织学变化。陈等人。显示 HIFU 诱导的含孔病变的组织学图像（1.7 MHz，原位I SAL，212–266 W/cm 2，5 s 暴露时间）[引文23 ]。既观察到病灶中心的直接组织损伤，也观察到治疗体积外的间接组织损伤，并得出结论，病灶区域外的间接组织损伤不可能是由于热传导造成的。然而，没有证据表明导致这种损害的机制。程等人。显示 HIFU 病变的组织学图像（1.68 MHz，空间峰值焦点强度 535–838 W/cm 2在兔子肌肉中产生温度< 100 °C 的热凝固，利用组织学与 MR 成像进行关联，在其中描绘出病变内的不同区域。他们描述了一个保留细胞形态的中心区域，周围有一个区域，他们称该区域具有“由于广泛的结构损伤而留下大量中空空间和破碎的肌肉纤维而形成的空泡特征”。就在该区域之外，他们描述了一个水肿、富含渗出物的组织区域。然而，没有解释 HIFU 与组织相互作用的相关机制是什么。引文24、引文25 ]。 Rabkin 及其同事使用被动空化检测来显示 HIFU 暴露期间超声图像中看到的超回声（1.1 MHz HIFU 换能器以 3.3 MHz 驱动，暴露时间为 10 秒，脉冲重复频率为 6.26 Hz，占空比为 80%，220–1710 W/cm 2的原位强度）仅在检测到惯性空化活动时发生[引文26 ]。相应的组织学显示，直径为 1-10 µm 的空洞遍布整个病变部位。然而，他们还表明，当检测到超声超回声时，焦点峰值附近的热电偶监测到的温度超过100°C。因此，可能发生了液体沸腾，但它们的组织学没有显示出沸腾的特征。为了解释这一点，作者认为，由于温度传感器尖端发生空化而产生的伪影，他们的温度测量结果可能被高估了。他们也不太可能避免粘性加热制品[引文27 ]。

在本研究中，我们旨在从组织学角度描述 HIFU 引起的肝损伤，并独立验证声空化活动，以确定产生组织学效应的机制。为此，对不同的暴露方案进行了组织学鉴定和表征，一种主要导致热效应，另一种导致热损伤并伴有声空化和组织水沸腾活动。

使用 1.7 MHz 聚焦单晶 MR 兼容换能器（焦距 6.4 cm，f 数 1.2，A2-2 西门子，德国）。声焦点的轴向半高全长 (FLHM) 为 1.2 厘米，径向半高全宽 (FWHM) 为 1.5 毫米（使用膜水听器（Precision Acoustics，英国）在自由场条件下测量）。使用反射目标辐射力天平进行声功率校准。引用的所有强度均为自由场空间峰值。

连接到换能器的有机玻璃指针可以进行视觉引导，以帮助定位每个肝脏中的 HIFU 焦点。肝脏的顶部自然是圆形的，肝脏的底部是平的。因此，我们选择暴露肝脏中部，肝脏前部位置的变化最大~1毫米。焦点峰位于肝脏后表面以及平台/吸收器前面 2 ± 0.5 mm（轴向精度）的水平面上。简而言之，移动受试者以使指针与肝脏平台的一侧边缘接触到叶的一侧，并记录轴向和横向位置。然后使指针以相同高度接触平台的另一侧，并记录该位置。如果轴向距离不同，受试者的支架水平旋转，直到平台水平，与换能器正面平行。一旦实现这一点，就将指针移开，并且受试者轴向移动远离换能器 2 毫米，从而将焦点峰值放置在距平台后表面 2 毫米的位置。使用缝合线将肝脏保持向下，以确保肝脏的后表面平放在平台上。

使用时间分辨率为 0.01 s 的定时器来触发波形发生器（Agilent，美国，33120 A），其输出传递到 60 dB A500 放大器（E&I Ltd，美国）。功率放大器和换能器之间连接50Ω阻抗匹配电路。电压和电流“拾取”盒连接在功率放大器和匹配电路之间，允许测量 V/1000，作为由于气泡形成而导致的声阻抗变化的独立指标。

先前描述的 PCD 空化检测系统 [引文[ 8 ]用于同时被动监测超声波和可听声发射，并通过测量HIFU驱动电压主动监测阻抗变化。此外，还对肝脏前表面进行了视频记录。使用的无源超声波压电陶瓷传感器（139303HR Aerotech Laboratories，Lewistown，PA）直径为 25 毫米，焦点为 70 毫米，中心频率为 7.5 MHz，带宽为 0.3–10 MHz，FLHM 1.2 cm 和 FWHM 1 mm（图1D）。检测到的信号首先通过 50 dB 陷波滤波器（F5181，Allen Avionics，Inc，Mineola，NY）以去除 HIFU 驱动（1.7 MHz），然后通过 7-8 MHz 带通滤波器（F5204 Allen Avionics，Inc， Mineola, NY）在 1.7 MHz 时提供了 50 dB 的额外衰减。三个宽带 (0.1–30 MHz) 低噪声 20 dB 前置放大器（7866，Advanced Receiver Research，伯灵顿，康涅狄格州，美国，噪声系数为 2.5 dB）放置在 (i) 陷波滤波器之前，(ii) 之前和 ( iii) 带通滤波器之后。使用安装在双总线台式计算机 (P4SCT) 中的 4 通道、100 MS/s、8 位数据采集卡 MI.2031（Spectrum Systementwicklung MicroElectronic GMBH，Grosshansdorf，德国）对 PCD 和电压传感器进行数字化和记录，SuperMicro Computer Inc，美国加利福尼亚州圣何塞）数据采集系统（DAQ）。这为 PC RAM (4 GB) 提供了快速的数据流。每次 HIFU 照射以及随后的短暂静止期（约 10% 的照射时间）都会采集数据，以便确定基线噪声水平。宽带（7-8 MHz）被定义为当信号超过平均关闭时间噪声水平加上两个标准偏差时被检测到。 FFT 电压幅度（VRMS）是使用每秒 2800 段的原始电压数据获得的。从每个时间点减去使用静止时间数据计算的基线噪声。将所得的扣除噪声的频率积分宽带数据绘制为曝光时间的函数。惯性空化检测由高峰度、随时间变化的宽带信号以及灵敏度稍低的驱动电压表示，如 McLaughlan 及其同事所描述的那样。引文8 ]。最后，计算每个时间图的总累积频率积分宽带（7-8 MHz）发射。每秒的累积宽带用于比较不同持续时间的暴露。

同时，使用防水麦克风（Partridge Electronics，Essex，UK，CHK00627，频率响应 0.03-17 kHz，80 dB 信号/噪声）在笔记本电脑上监测声音发射（1-20 kHz）。音频编码软件（Smart PC Recorder，v2.5）允许以 44.8 kHz 的速率和 16 位分辨率进行采样。麦克风放置在无源超声波检测器附近，如图所示图1。使用 MatLab 编写的频谱分析代码对数据进行分析。沸腾引起的排放具有一种特有的“爆裂”声，频谱分析表明该声音在 2-6 kHz 范围内最为强烈 [引文8 ]，而惯性空化则通过在 12-20 kHz 范围内最强烈的发射来表明，并且听起来更像是“嘶嘶声”。声音信号监测与驱动电压监测一样，其灵敏度低于超声波监测。空化监测系统的最后一个元件是摄像机，它能够以 30 fps 的帧速率（分辨率 648 × 648）记录肝脏表面和紧邻其前面的耦合介质的外观。研究了视频帧中可见气泡的出现和肝脏的运动。

将换能器、PCD 传感器、麦克风和摄像机放置在 37°C 脱气水箱（∼14 L）中（图1C）。 PCD 传感器以约 45° 的角度询问 HIFU 焦峰，并进行对准以最大化从目标反射的 HIFU 信号。最后，将连接到换能器的机械指针的尖端在视觉上与滚珠轴承对齐，并且放置摄像机以允许对指针的尖端进行成像，并且将麦克风安装在指向肝脏的支架中。

选择旨在导致消融的曝光，理想情况是在肝脏前表面和后表面上都可见病变。通过监测低频（2-6 kHz）声音发射来研究潜在的物理损坏机制[引文8 ] 识别“沸腾”，宽带声发射指示惯性空化。在末期麻醉下（附录 A ）进行的初步实验（ 每个暴露水平n = 10 个病灶）确定了适合评估发生以下效应的病灶组织学外观的暴露水平：

T + AC + B – 热 (T)、声空化活动 (AC) 和组织水沸腾 (B) 暴露：2750 ± 200 W/cm 2持续 4 秒。

T (+AC) – 热 (T) 和可检测声空化 ((+AC)) 暴露：1750 ± 120 W/cm 2持续 6 s。

损伤是一个接一个地产生的，通常间隔一分钟。第一个和最后一个损伤产生之间的时间不超过 30 分钟。为了考虑受试者之间的差异，在每只动物中放置了多种损伤类型的组合。 T + AC + B 用于定义适当的病灶位置，最大限度地减少病灶之间的相互作用。最高强度病变（~3毫米）和肝叶（~20-25毫米）的平均宽度意味着4个最小间隔为4毫米的病变可以放置在一个肝叶中而不会相互作用。没有任何检测到的宽带发射的纯“热”方案需要超过 60 秒的暴露时间（使用~800 W/cm 2的强度水平））大大超过了空化检测的最大可用持续时间（12秒），因此没有进行研究。治疗结束时，受试者要么立即被宰杀（评估的每个时间点至少有 3 个病灶），并切除肝脏进行组织学检查，要么用可吸收缝线修复伤口并用金属自动夹闭合。允许康复的受试者被维持在癌症研究所的专门动物设施中，直到达到免疫组织化学分析所需的时间点。

从每个受试者身上切下两个肝叶，一个包含 HIFU 病变，另一个未经过外化操作或暴露于 HIFU，提供对照组织。将叶用福尔马林固定并石蜡包埋，并从与其后表面大约平行、深2毫米的平面上截取切片。对于每个染色/标签，至少准备 3 个切片。切片用 H&E 染色 [引文28 ]（HIFU 治疗后立即和 7 天进行的评估）和/或天狼星红米勒染色（HIFU 治疗后 7 天进行的评估），如附录 B中所述。对于免疫组织化学分析，切片在二甲苯中脱蜡两次，每次 5 分钟，并在 100%、90% 和 70% 乙醇中重新水化。然后用流水冲洗 2 分钟。对于抗原修复，载玻片在 10 mM 柠檬酸盐缓冲液（pH = 6）中微波加热 15 分钟，用蒸馏水洗涤，与 3% 过氧化物酶块一起孵育 30 分钟，用蒸馏水洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后用 Tris 缓冲盐水 (TBS) + 0.05% Tween 重复。将载玻片与无血清蛋白块 (Dako) 一起孵育 2 小时，然后与适当的一抗（以百分之一的稀释度在缓冲液中）在 4 °C 下孵育过夜。这些抗体包括裂解的 caspase-3（在 HIFU 后 1.5、6（补充材料中描述）、12 和 24 小时进行评估）、Hsp70（0（补充材料中）、1.5、3（补充材料中）进行评估，6（补充材料）、HIFU 后 12、24 和 96 小时）、CD68（HIFU 后 1.5、12、24 和 96 小时进行评估）和 ki-67（HIFU 暴露后 1.5、12 和 24 小时进行评估）抗体。第二天，用 TBS/0.05 Tween 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟，并与过氧化物酶标记的抗兔聚合物一起孵育 40 分钟（DAKO envision 试剂盒）。最后用TBS/0.05% Tween清洗3次，每次5 min，脱水并封固，如图所示用 TBS/0.05% Tween 清洗 3 次，每次 5 分钟，然后脱水并封片，如图所示用 TBS/0.05% Tween 清洗 3 次，每次 5 分钟，然后脱水并封片，如图所示附录A。使用具有 4x、10x 和 20x 物镜的 Olympus BX51 显微镜（Olympus Optical Co. Ltd，伦敦，英国）进行显微镜检查。使用直接连接到运行 Olympus Cell P 软件的计算机的数码相机（ColorView 12；Soft Imaging System GmbH，Munster，德国）获取图像。电动扫描台（Prior Scientific Instruments Ltd，剑桥，英国）在由 ANALYSIS 自动软件（软成像系统）驱动时能够采集复合平铺图像。

定量空化监测结果显示为平均值±标准差。每只动物的平均宽带活动的偏差。使用 Mann-Whitney U（或 Wilcoxon）检验计算统计显着性（p 值），如果p  < 0.05，则假定显着。

为了研究水/肝界面处发生的空化现象，在脱气水中使用 Melinex 膜和固定在 Melinex 膜上的 5 毫米厚的圆顶橡胶吸收器进行实验，HIFU 焦点位于其后表面前面 2 毫米处。 2750 ± 200 W/cm 2 4 秒暴露的样本图均显示检测到的宽带活动连续性升高（图2A、B）。当 Melinex 膜放置在焦点前 2 mm 处时，绘图的特征是离散事件和持续 1.5 秒的连续水平升高 (500–1000 mVRMS)。相应的音频数据显示发射仅在 12-20 kHz 范围内。宽带活动水平的升高与音频数据中的类似发现并不相符。出现了一个与宽带高程周期一致的非常小的不透明中心点（图2A）。吸收器就位后，升高的信号为 ∼75–200 mVRMS。吸收体表面不在焦峰处；因此，压力的幅度较低。在这些曝光过程中拍摄的照片显示橡胶表面出现不透明斑点（图2B）。声音图显示 12 至 20 kHz 之间的低幅度连续发射块。 12 kHz 以下没有明显的发射。

图 2. HIFU 病变的空化监测。在 (A) 检测到的宽带数据示例中，相应的声音发射和视频中的图像是在 2750 ± 200 W/cm2 下使用 2 mm 预聚焦的 Melinex 膜在水中曝光 4 秒时拍摄的。在 (B) 中，在 2750 ± 200 W/cm2 的水中暴露 4 秒期间检测到的宽带数据和相应的可听发射，其中大鼠肝形橡胶吸收器的 HIFU 焦点距离其后表面 2 毫米，如图所示体内实验。在 (A) 和 (B) 中，发射持续升高（在 50 至 200 mVRMS 范围内，具有相对较高的本底噪声）。同样在 (B) 视频中的 3 个图像帧。黄色虚线圆圈内包含的不透明区域在曝光开始后立即出现，并持续到曝光结束。在 (CE) 中，显示了暴露于 T+AC+B 暴露的肝脏的宽带发射、驱动电压波动和傅立叶变换图的代表性图。 T+AC+B 暴露观察到的驱动波动与宽带活动密切相关，并加强了两次暴露期间惯性空化的检测 (D)。声音发射（箭头所示）证实了 T+AC+B 病变 (E) 中的沸腾（强烈的 2-6 kHz 发射）。在 (F–H) 宽带发射的代表性图中，分别显示了暴露于 T(+AC) 暴露的肝脏的驱动电压波动和傅立叶变换。 T(+AC) 图中 12 至 20 kHz 之间的可听发射对应于惯性空化 (F)。在曝光开始和结束时看到的声音尖峰 (12-20 kHz) 是 HIFU 驱动器打开/关闭（G 和 H）产生的伪影。 T(+AC) 损伤 (G) 中的低频 (∼2 Hz) 周期性驱动电压波动与呼吸运动相关。T(+AC) 损伤 (G) 中的低频 (∼2 Hz) 周期性驱动电压波动与呼吸运动相关。T(+AC) 损伤 (G) 中的低频 (∼2 Hz) 周期性驱动电压波动与呼吸运动相关。