鼠伤寒沙门氏菌(S.T)是自然界中广泛分布的有毒沙门氏菌菌株。传统的检测方法难以同时满足现场检测活菌和死的毒性病原体以及菌株特异性的要求。双模信号策略是应对这些挑战的一种简单可行的途径。它可以分别检测活细菌和总细菌，根据差异获得死细菌。此外，还可以通过活细菌占细菌总数的比例来获得细菌活力。
三磷酸腺苷触发生物发光(ATP-BL)由于仪器便携、操作简单，是现场检测活菌的常用技术。然而该方法缺乏特异性，且溶菌效率低限制了传统生物发光方法的灵敏度。基于气体压力的策略可以在密封装置中以较小的气体体积变化获得灵敏的压力信号响应，并易于用压力计测量。因此，选择生物发光和压力进行双模式信号生物测定是有希望的。
宁波大学干宁教授和余镇重助理研究员在学术期刊Analytical Chemistry上发表了题为Versatile Platinum Nanoparticles-Decorated Phage Nanozyme Integrating Recognition, Bacteriolysis, and Catalysis Capabilities for On-Site Detection of Foodborne Pathogenic Strains Vitality Based on Bioluminescence/Pressure Dual-Mode Bioassay的研究成果。该团队用具有模拟酶催化活性的新型纳米材料合成的纳米酶作为生物传感器中的信号探针。铂纳米颗粒(PtNP)是经典的类过氧化物酶纳米酶，具有独特且优异的催化能力，可将H2O2分解为O2大大增强压力信号。通过与噬菌体结合，新设计的PtNPs修饰的噬菌体纳米酶被赋予了识别细菌菌株的能力。因此，设计的PtNPs标记噬菌体信号探针集成了识别、溶菌和催化能力。
图1展示了噬菌体探针的制备流程和检测原理示意图。采用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDDA)修饰的S.T噬菌体1玻璃微球(GM@P1)作为传感探针来捕获目标细菌。同时，通过Cu2+的静电吸引，将PtNP纳米酶标记在另一个筛选的S.T噬菌体2(P2@PtNPs)上作为信号探针。在标准检测过程中，由于两种噬菌体的结合位点不同，将GM@P1和P2@PtNPs与目标S.T振荡孵育，形成GM@P1/S.T/P2@PtNPs的三明治结构。随后，GM沉没并以静止状态分离。最后，随着H2O2的添加，分离的沉淀物中引入的PtNP催化H2O2产生大量的O2。增加的气压信号可以通过手持式气压计进行量化，该信号对应于S.T的总数。同时，活体S.T在·OH(由PtNPs和H2O2产生)和噬菌体的协同作用下被破坏，释放出ATP，产生ATP-BL信号，通过便携式BL计定量，该信号与活体S.T浓度相对应。因此，死菌数是根据细菌总数和活菌数的差值得出的。此外，细菌活力是根据活菌在细菌总数中所占的比例得出的。
图1：(A)GM@P1和(B)P2@PtNPs的合成过程。(C)设计的双模式生物测定的示意图。
该团队利用噬菌斑实验研究了功能化P1和P2(即GM@P1和P2@PtNP)的特异性。选择不同的致病菌种类（金黄色葡萄球菌S.A、大肠杆菌E.C和副溶血弧菌V.P，108 CFU/mL）作为对照。如图2A、2F所示，GM@P1和P2@PtNP仅在与目标S.T(ATCC 14028)一起孵育的培养皿上产生噬菌斑。此外，将GM@P1和P2@PtNPs与不同的沙门氏菌菌株(108 CFU/mL)一起孵育。噬菌斑仅在目标S.T (ATCC 14028)存在时出现(图2A-J)。这些结果表明，GM@P1和P2@PtNPs对宿主细菌保持了高菌株水平特异性。该团队还研究了噬菌体对活细菌和死细菌的识别能力。如图2K所示，当新鲜培养的S.T(例如活S.T)用碘化丙啶(PI，一种对死细胞染色的红色荧光染料)染色时，没有观察到红色荧光信号，表明S.T包括活细胞。然后，将S.T与SYTO 13标记的P1一起孵育，S.T周围出现绿色荧光信号，表明P1可以与活靶标S.T缀合。
图2：(A-E)GM@P1和(F-J)P2@PtNP的噬菌斑分别与不同的S.T菌株一起孵育。(K)分别与活S.T、死S.T和活/死S.T孵育的P1的荧光显微镜图像。
该研究策略中的ATP释放原理如图3A所示。一方面，P2@PtNPs中的噬菌体具有溶菌能力，可以裂解S.T释放ATP。另一方面，P2@PtNPs中的PtNPs和Cu2+可以固定在S.T表面并催化H2O2生成大量· OH。通过两种方法的结合，ATP可以从捕获的S.T中完全释放，从而导致BL信号显著改善。
图3：(A)溶菌示意图。(B)S.T与P2@PtNPs、H2O2+PtNPs、H2O2+P2和H2O2+P2@PtNPs孵育的BL信号。(C)空白(PBS)、PtNP、P2、P2+PtNP和P2@PtNP的溶菌效果。(D)空白(ATP)、P2@PtNPs+H2O2、溶菌酶和SDS对ATP-BL反应的影响。(E)S.T与SDS、溶菌酶和H2O2+P2@PtNP一起孵育的BL信号。(F)相应的生物发光图像。(G)BL传感策略的可行性。(H)PBS、H2O2、H2O2+P2、H2O2+PtNPs和H2O2+Phage@PtNPs在封闭管中30分钟的气压值。(I)传感策略的可行性(J)P2@PtNPs、PtNPs和过氧化氢酶的米氏曲线。(K)H2O2的过氧化氢酶、PtNP和P2@PtNP的Lineweaver-Burk图。
气压测定操作如图 4A 所示。气压随S.T浓度成比例增加(图4B)。在102−107 CFU/mL范围内，气体压力变化值(ΔP)与S.T浓度对数([S.T])之间存在良好的线性关系：ΔP=729Log[S.T]−1066(Pa,R2=0.996,n=3,图4C)。检测限为30 CFU/mL。此外，ATP-BL测定操作如图4D所示。在图4E中，BL信号随着S.T浓度的增加而增加，并且BL值的对数([BL])与S.T浓度的对数([S.T])在102−107 CFU/mL范围内表现出良好的线性关系，且LOD为40 CFU/mL。气压法定量的S.T为总S.T浓度，ATP-BL法定量的S.T为活体S.T浓度。这样，就可以从它们的差异中得到死的S.T。
图4：(A)气体压力测量过程。(B)检测不同浓度S.T的气压图。(C) P变化值和S.T浓度对数之间的校准图。(D) ATP-BL信号测量过程（图中的样品是气压测量后的）。(E)检测不同浓度S.T的 ATP-BL信号图。(F)从便携式生物发光计获得的ATP-BL信号的对数与S.T浓度的对数之间的校准图。
DOI：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c01192
声明：我们尊重原创，也注重分享，不作商业用途，仅作交流学习，版权归原作者，如有侵权敬请谅解，联系我们删除， 我们将在24小时之内删除。
