牙周病影响牙龈和牙周组织，是世界上最常见的炎症性疾病之一。牙周病症状表现为从健康的牙龈开始，经过牙龈炎再发展为牙周炎。牙齿表面的益生菌群落被认为是与牙周炎相关的主要病因，因此可以为诊断测试提供一系列生物标志物。益生菌群紊乱会使免疫反应失调，导致慢性炎症并直接破坏牙齿支撑组织。临床上，福赛斯坦纳菌与牙周病的严重程度呈正相关，在一项研究中，较高的细菌负荷增加了平均附着损失。因此，福赛斯坦纳菌细胞或相关生物标志物的检测可以提供一种有用的诊断方法，对牙周炎的早期干预及治疗评估具有重要意义。
波兰克拉科夫雅盖隆大学生物化学、生物物理学与生物技术系微生物系Danuta Mizgalska团队在期刊FEBS openbio上发表了研究，他们使用SELEX程序筛选了两个高亲和力适配体，并测试了一系列福赛斯坦纳菌突变体以确定相应的分子靶点。获得的特异性结合福赛斯坦纳菌的适配体，可以作为未来研究牙周炎患者口腔微生物组的研究工具的基础，并有可能开发新的诊断方法。
图1：福赛斯坦纳菌细胞适配体的序列和结构。
结合福赛斯坦纳菌细胞的核酸适配体筛选采用标准细胞-SELEX法，选择压力逐渐增大。不同菌种(大肠杆菌和牙龈假单胞菌)进行两轮对比选择。经过8轮筛选，适体结合达到饱和状态。对选定的寡核苷酸进行测序和分析。最丰富的10个适体序列(共371782个序列)根据相似性得分组成两个聚类。两个最丰富的序列(TF1和TF2)分别占整个池的7.3%和7.1%。二级结构预测没有明显的相似性(图1)。
图2：流式细胞术分析所选FAM标记适配体的结合特异性。(A)直方图显示在浓度为250 nM时，福赛斯坦纳菌细胞与适配体TF1、TF2和阴性对照适配体的结合。(B)恒定数量福赛斯坦纳菌细胞存在下，适体在0~250 nM浓度下结合的饱和曲线(6.8×107)。(C, D)选择的FAM标记适配体对(C)不同细菌种类和(D)不同福赛斯坦纳菌基因敲除突变体的结合特异性。适体浓度为250 nM，每个物种或突变体使用6.8×107个细菌细胞。实验进行了两次，有两次技术重复。数据以阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)标准偏差表示。所用缩写: Aa, 伴放线放线杆菌; Ec, 大肠杆菌; Fn, 具核梭杆菌; Pgin, 牙龈卟啉单胞菌; Pgul, 古卟啉单胞菌; Pi, 中间普雷沃菌; Pm, 微小单胞菌; Sg, 格氏链球菌; So, 口腔链球菌; Ss, 血链球菌; Tf, 福赛斯坦纳菌; Ts, 蛇形坦纳菌。
利用流式细胞术分析了TF1和TF2与福赛斯坦纳菌细胞的结合情况。TF1和TF2都与福赛斯坦纳菌细胞具有高亲和力结合(图2A)。TF2的平均荧光强度(MFI)最高，为63.2±4.1。TF1的MFI为55.63±1.72。在测定MFI之前，将固定数量的细菌(6.8×107)与不同浓度的适体(0-250 nM)孵育1 h，以确定解离平衡(Kd)。我们观察到典型的饱和结合曲线，根据非线性回归曲线拟合估计，TF1的Kd值为9.86 nM， TF2的Kd值为13.33 nM(图2B)。然后，将该适体与其他多种细菌孵育，以检测其特异性。采用流式细胞术分析TF1和TF2的结合，每个适配体250 nM，6.8×107个细菌细胞。这表明除了福赛斯坦纳菌细胞外，细菌没有统计学意义上的结合(图2C)。另外，还在ATCC 43037菌株的背景下测试了一些福赛斯坦纳菌突变体，以确定每个适体的结合对象。福赛斯坦纳菌ΔTfsAB突变体，缺乏高度组织化的半结晶S层，仍然能够结合这两个适配体，表明这两个适配体都不靶向TfsA或TfsB(图2D)。此外，还测试了缺乏分泌KLIKK蛋白酶karilysin和mirolysin以及两种细胞表面蛋白酶抑制剂miropin和potemin A的突变体。与野生型菌株相比，mirolysin缺陷突变体对两种适体的结合亲和力显著降低，TF1的MFI降至11.35%，TF2降至7.9%(图2D)。这些数据表明，尽管预测的二级结构不同，TF1和TF2仍能与mirolysin或mirolysin修饰蛋白特异性结合。
本文筛选了两个具有高亲和力和特异性的结合福赛斯坦纳菌细胞的适体，这两种适体似乎都能与T9SS分泌的相关蛋白酶mirolysin(或经mirolysin修饰的细菌表面靶标)结合。仅福赛斯坦纳菌中存在编码mirolysin的基因，表明适体对其他牙周病原体的低交叉反应性。这使得它们成为开发新的研究工具、诊断探针甚至治疗牙周炎的新疗法的线索。
论文信息：doi:10.1002/2211-5463.13772.
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