非洲猪瘟病毒(ASFV)是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，具有传染性和极高的致病率。已发现高毒力的ASFV分离株可在4-15天内导致家猪和野猪100%的死亡率。由于缺乏有效的疫苗或可用的治疗方案，非洲猪瘟给养猪业造成了严重的经济损失。目前的ASFV检测方法主要包括基于基因检测的方法和抗体检测。基于定量聚合酶链反应(qPCR)的基因检测因其高灵敏度已成为ASFV检测的金标准。然而，这种方法样品前处理耗时、专业要求高。抗体检测提供了一种更简单、更容易的方法，这些基于抗体的方法的分析性能在很大程度上取决于抗体或重组抗原的质量，但它们的生产相对复杂。而适配体由于其低成本、高亲和力和独特的化学特性，被认为是开发ASFV诊断工具的理想候选体。为了监测ASFV的传播，p30蛋白在ASFV感染期间的早期和长期表达已被确定为理想的感染标志物，p30特异性适配体可用于开发一种早期、低成本和即时的ASFV检测方法。
湖南工业大学生物医学纳米材料与器件湖南省重点实验室邓燕教授团队发表了最新研究，本研究通过磁珠指数富集配体系统进化(MB-SELEX)筛选了靶向ASFV p30蛋白的适体。经过7轮SELEX和进一步编辑和鉴定适体，获得了最佳的Atc-20截断适体(Kd=140±10 pM)。此外，基于Atc20设计了适体/抗体异质性夹心检测方法，实现了ASFV p30在8~125 ng/mL范围内的线性检测，检出限(LOD)为0.61 ng/mL。该方法具有良好的分析性能，可有效检测稀释后血清样品中的p30蛋白，为开发ASFV生物传感器提供了良好的前景。
图1：针对ASFV p30蛋白特异性适配体的MB-SELEX策略流程图及抗体/适配体夹心试验原理。
该磁珠-SELEX通过将目标ASFV p30蛋白固定在MB上，并与随机寡核苷酸文库孵育以筛选适体(图1)。NHS-MB含有N-羟基琥珀酰亚胺官能团，可与p30蛋白上的伯胺反应形成稳定的酰胺键从而固定蛋白。筛选过程通过qPCR监测，根据相应的阈值周期(Cq)拟合定量曲线，并计算每轮ssDNA的保留率。MB-SELEX与qPCR的结合筛选适体的效率更高。本实验设计利用ASFV p30单克隆抗体和Atc-20建立抗体/酶联适体夹心实验检测ASFV p30蛋白，其中p30单克隆抗体作为捕获元件，用辣根过氧化物酶(HRP)标记的适体Atc-20作为识别元件。
图2：(a)拟合的标准定量曲线，文库浓度对数(10-3-10-8 μM)与Cq值呈线性相关，R2= 0.998；误差条对应于三次重复测量的标准差(n=3)。(b)第1-7轮的保留率。(c) 1-7轮纯化产物的扩增曲线。曲线在x轴上平移以提高对比度。(d)第1-7轮纯化产物的熔化曲线。曲线显示随温度升高的荧光变化。
ASFV p30蛋白经过7轮MB-SELEX筛选。ssDNA浓度对数与Cq值的线性相关关系如图2a所示。如图2b所示，总体保留率呈上升趋势。第三轮不寻常的下降可能归因于添加了猪血清，其中含有复杂的成分混合物。同时它也表明成功地去除非特异性适配体。保留率在第6轮和第7轮达到更高的值。分析每轮纯化产物的qPCR扩增和熔化曲线，以全面评估SELEX进展(图2c,d)。扩增曲线如图2c所示，1-4轮荧光明显下降。第5轮后下降幅度明显减小，出现扩增曲线平台，对应于SELEX持续的随机非特异性寡核苷酸减少。同样，如图2d所示，ds-DNA异源双链体(Tm在70-72 ℃)的减少和同源双链体(Tm在82-87 ℃)的增加分别导致熔融峰在71 ℃和85 ℃附近逐渐下降和上升。这些现象证实，ssDNA文库在第5-7轮ssDNA汇聚后已经富集。考虑到第6-7轮的保留率没有进一步上升，SELEX在第7轮终止。
图3：(a)夹层法的特异性。ASFV p30蛋白检测浓度为0.2 μg/mL，其他蛋白检测浓度为2 μg/mL;混合组为0.2 μg/mL和2 μg/mL其他蛋白。(b)夹心法的ASFV血清样本分析。血清用0.01 M PBS稀释。误差条对应于三次重复测量的标准偏差(n=3)。
该试验的特异性是用十倍浓度的可能与p30蛋白同时出现的蛋白质进行评估，以确定其对复杂样品的鉴别能力。从图3a可以看出，猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白(PRRSV N)、金黄色葡萄球菌肠毒素A型重组蛋白(SEA)、猪免疫球蛋白G (IgG)样品的非特异性信号非常低，与对照组接近。此外，ASFV p30和混合组表现出强烈的信号。在混合组中，由于存在可能阻碍p30捕获的干扰蛋白，观察到信号略有下降。ASFV血清样本分析如图3b所示。在不同的稀释倍数下，阳性血清的信号比阴性血清高数倍，说明在适当的稀释倍数下，夹心法能有效区分含ASFV的血清和阴性血清。阴性血清由于成分复杂，结果存在噪声信号。
本实验采用MB-SELEX筛选ASFV p30蛋白适配体B，经过7轮SELEX筛选，成功筛选出ASFV p30蛋白特异性适配体。所选适配体的Kd值为170±6.2 pM。此外，截断适体以增加与p30蛋白的结合亲和力，在缺失20 nt核苷酸的情况下获得了较低的Kd值140±10 pM。此外，基于Atc20设计了适体/抗体异质性夹心检测方法，实现了ASFV p30在8~125 ng/mL范围内的线性检测，检出限(LOD)为0.61 ng/mL。该适体表现出良好的性能。不足的是当适体作为捕获元件固定在平板上时，蛋白质捕获效率显著降低，阻碍了ASFV的检测。后续研究应根据适配体与蛋白质的结合情况，探索更可行的适配体固定方案或对适配体进行修饰，以获得更广泛的应用。筛选出的ASFV p30蛋白特异性适配体可用于ASFV生物传感器的开发和ASFV早期检测。
论文信息：10.1038/s41598-024-53619-7.
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