Prymnesium parvum是一种有毒的单细胞附生菌，对温度和盐度耐受性高，使其能够在海水、内陆河流、溪流等各种环境中生存。P. parvum形成的有害藻华(HABs)依靠毒素杀死鱼类和贝类，导致水生生物死亡率上升，同时也会消除生态系统中的竞争藻类，最终成为单特异性水华，造成重大经济损失。该物种经常在我国的水产养殖池塘中发现，通常密度较低，但其环境适应能力强、增殖迅速，早期监测对生态保护和水产养殖发展至关重要。
高灵敏度分子检测技术可以解决传统显微镜方法难以快速区分形态相似性和隐种方面的缺陷，被认为是一种稳健和高效的新方法，如聚合酶链反应(PCR)、定量PCR (qPCR)和等温扩增技术等。相比于反应时间长、设备精度要求高的PCR和qPCR，等温扩增更适合现场检测。在等温扩增方法中，环介导的等温扩增(LAMP)需要复杂的引物(6对)，而重组酶聚合酶扩增(RPA)只需要一对简单的引物。此外RPA反应可在37℃等温条件下20分钟内完成。但其敏感性和特异性有待进一步提高。有研究报道，CRISPR RNA (crRNA)与靶序列结合时，CRISPR相关(Cas)蛋白的特异性反式作用(单链DNA, ssDNA)也会被激活，并且非特异性地切割系统中的ssDNA。系统中添加修饰的ssDNA报告分子将获得检测信号。因此，RPA与CRISPR-Cas系统配对，其灵敏度和特异性可能会进一步提高。
宁波大学海洋学院姜海波教授采用RPA和CRISPR-LbaCas12a-LFD的策略实现从不同环境水样中检测P. parvum，也是首个将其应用于HAB物种检测的研究。RPA作为预扩增步骤，CRISPR-LbaCas12a作为检测靶基因的信号转导步骤。两种方法相结合，显著提高了HAB检测的敏感性和特异性，特别是对低密度的有害藻华物种。RPA-CRISPR-LbaCas12a-LFD方法通过横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)实现快速读数显示，将作为早期发现和预防HAB事件的有效模型。
图1：RPA-CRISPR-LFD检测原理。
P. parvum 基因组DNA(gDNA)通过RPA产生大量扩增子。这些具有与crRNA结合能力的扩增子能够激活Cas12a的反式(ssDNA)DNase活性(图1)。在荧光检测中，ssDNA荧光基团(FAM)和淬灭剂(TAMRA)分离产生荧光，可用来筛选最佳的crRNA和RPA引物(图2)。在LFD方法中，生物素和FAM分离形成条带。生物素端留在控制线处，而携带FAM的金颗粒被捕获在测试线处。此外，少量金粒子逃逸，导致在测试线上形成微弱的条带。因此，通过控制PEG浓度和金颗粒数量，尽可能地消除阴性测试线的轻微带状现象。
图2：筛选crRNA (crRNA-1、crRNA-2、crRNA-3)和RPA引物(RPA-1、RPA-2、RPA-3)：(a)3种crRNA的阳性与阴性荧光强度；(b) crRNA-2序列；(c) 3对RPA引物的独立RPA扩增效率；(d) 3个RPA引物RPA-CRISPR-LbaCas12a方法的荧光强度。
研究团队为了评估所提出的RPA-CRISPR-LbaCas12a-LFD检测的特异性，选择在基因序列上具有显著相似性的I. galbana和C. dentata，中国沿海地区常见的3种HAB：P. donghaiense、K. mikimotoi和S. costatum，以及两种常见的产毒K. veneficum和P. multiseries作为对照。研究结果显示，大多数物种对检测没有干扰(图3a,c)。在该研究中，优化缓冲液后RPA的检出限为1.5×102 pg/μL。与单独RPA相比，加入CRISPR后其灵敏度提高了10,000倍，实现了gDNA浓度的检测限为1.5×10-2 pg/μL(图5b,d)。
图3：特异性和敏感性验证：(a,b) RPA-CRISPR-LbaCas12a-LFD(原始LFD试纸)；(c,d) RPA-CRISPR-Cas12a-LFD(修剪后的LFD试纸条)。M：DNA标记。NC：阴性对照。
由于环境水样通常被杂质污染，因此，研究团队利用加标样品来确认杂质对RPA-CRISPR-LbaCas12a-LFD方法检测结果的影响。结果表明，该方法的灵敏度是独立RPA检测方法的1000倍。利用采集的51个环境水样，验证了该方法的适用性和准确性(图4)。结果显示，51份样本中有37份呈阳性。这表明，P. parvum在中国沿海水域普遍存在，但在采样期间，其在水中的浓度较低。
图4：RPA-CRISPR-LbaCas12a-LFD法分析环境水样。渤海14个水样(B1~B14)，东海连江14个水样(L1~L14)，东海三门湾6个水样(SM1~SM6)，东海象山湾2个水样(XS1、XS2)，南海15个水样(SS1~SS15)。
该研究首次建立了一种快速、准确、高特异性、超灵敏的RPA-CRISPR-LbaCas12a-LFD检测方法，用于环境水样中HAB的检测。这种新型的检测方法不需要昂贵的设备或专业的技术人员，能够在恒温条件下便捷地检测出P. parvum，为野外环境中有害藻华的现场预警检测提供思路。
Doi：https://doi.org/10.1016/j.aca.2024.342797
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