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副溶血性弧菌广泛存在于海产品、海洋及河口生态系统中，能够引发鳃腐病、虾红体病、早死综合征以及急性肝胰腺坏死病等多种水生物种疾病，给海水养殖业造成重大经济损失。我国水产养殖允许使用氟苯尼考以及部分磺胺类和喹诺酮类抗生素。由于缺乏严格的监控与管理，抗生素滥用加剧了海水养殖环境中副溶血性弧菌的抗菌素耐药性问题。近年来，等温核酸扩增方法在食源性致病菌和耐药基因(ARGs)检测中的应用明显增加。重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术能在温和的温度条件下，在5-20分钟内将目标核酸扩增直可检测水平。然而，气溶胶交叉污染风险阻碍了RPA在现场开放环境的应用。
具有高通量和自动化操作能力的微流控技术，能够整合样品处理、核酸扩增和检测过程至单一芯片中。其中，离心式微流控芯片利用离心力通过微通道将样品及反应体系均匀分布于检测微孔内，最大程度的降低交叉污染的风险，在食源性细菌及ARGs现场检测方面展现出巨大潜力。近日，中国计量大学蒋晗副教授和吕晨泽副教授研究团队开发了一种快速、准确的IMS-RPA-微流控检测技术，集成样品浓缩、核酸提取及等温扩增步骤，实现副溶血性弧菌及相关ARGs的实时监测，相关研究成果发表于高水平期刊Food Control。该研究利用优化后的免疫磁分离技术(IMS)完成样品的预处理和靶向富集，采用创新设计的离心微流控芯片检测副溶血性弧菌及其floR、sul1和qnrA基因。与传统检测方法相比，该技术对实验条件和操作人员的要求明显降低，为现场快速监测食源性微生物及其ARGs的挑战提供可行的解决方案。
图1：免疫磁分离技术(IMS)联合RPA-微流控法同时检测海产品中副溶血性弧菌及其耐药基因的操作流程及原理示意图。
该研究使用的微流控芯片为直径80毫米、厚度2.5毫米的紧凑圆盘结构，包含8个独立单元，每个单元均设有1个样品孔、1个排气口和4个微反应室(图2a,b)。每个微反应室内预先装载扩增体系混合物。位于微反应室前的球阀负责确保反应混合物能够顺利转移并填充反应室完成核酸扩增及检测。在检测时，通过微流控芯片的样品孔注入样品液，随后使用密封膜对样品孔进行封闭。然后，将组装好的微流控芯片置入检测装置中。样本液通过离心力均匀分布于各个反应室内，在设定温度下进行实时荧光RPA反应。检测装置收集和处理每个反应室的荧光信号，最终获得样品液的实时扩增曲线(图2c)。
图2：副溶血性弧菌高度保守的物种特异性基因toxR和3个耐药基因floR、sul1和qnrA的RPA-微流控芯片检测平台原理图。(A)离心微流控芯片结构示意图。(B)芯片上各功能单元的详细示意图。(C)RPA -微流控芯片的整套检测程序。
IMBs数量显著影响IMS方法的灵敏度，为获得最佳的捕获效率(CE)，研究人员实验了多种浓度的IMBs，根据结果确定0.4 mg为副溶血性弧菌最佳使用量(图3A)。同时测试获得最佳孵育时间和孵育温度(图3)。当副溶血性弧菌在104 CFU/mL时，CE约为91.87%±1.8%，非目标细菌的CE保持在15%以下，因此优化后的IMS技术IMBs对副溶血性弧菌具有明显的特异性(图3E)。
图3：优化IMS技术的(A)免疫磁珠用量、(B)孵育时间、(C)分离时间、(D)副溶血性弧菌浓度、(E)特异性。
研究团队采用常规培养法、qPCR法和该研究开发的IMS-RPA微流控法三种方法对180份实际样本进行分析检测分析。结果显示，共有112个样本被确定为副溶血性弧菌阳性，三种方法获得结果一致性达到100%。采用IMS-RPA-微流控技术和qPCR检测112株副溶血性弧菌中floR、sul1和qnrA 这3种ARGs的存在情况(图5A-G)。检测结果证实IMS-RPA微流控方法具有优异的特异性、灵敏度和检测精度，该技术高效、可靠，能够同时检测海产品样品中的副溶血性弧菌和多种ARGs。
图4：(A-G)RPA-微流控法同时检测海产品样品中副溶血性弧菌及其耐药基因floR、sul1和qnrA。(H)芯片上各功能单元的详细视图。
论文信息：
https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2024.110653
作者介绍：
第一作者：蒋晗，副教授，中国计量大学生命科学学院，农产品品质控制与改良研究所副所长。主要研究方向为微生物适应性机制、基于恒温核酸扩增的快速检测方法与仪器。主持国家自然科学基金、浙江省自然科学基金、浙江省公益技术应用研究项目、参与国家重点研发计划、浙江省重大科技专项等，发表SCI论文10余篇，授权发明专利 6项。
通讯作者：吕晨泽，副教授，中国计量大学生命科学学院，农产品品质控制与改良研究所副所长。主要研究方向为针对农业关键性状的快速检测技术与设备，包括基于核酸适配体的生物分子检测技术以及基于恒温核酸扩增微流控芯片的微生物检测技术，主持国家自然科学基金、浙江省公益技术应用研究项目，参与国家重点研发计划、国家重大科研仪器研制项目等项目，发表SCI论文10余篇，申请发明专利11项。
