氧氟沙星(OFL)是一种人工合成、广谱抗菌的氟喹诺酮类药物。它通过抑制DNA拓扑异构酶和DNA旋转酶来阻止细菌的DNA复制，从而起到抗菌作用。氟沙星的自然降解过程缓慢，能够在环境中时间长残留，如果使用不当可能会对畜牧业甚至人类的生命健康造成威胁。常用的抗生素检测方法包括电化学检测、微生物检测和液相色谱质谱，但这些方法不适合现场检测。因此，需要开发高效灵敏的现场检测方法。近年来，生物传感器被广泛用于医疗、食品和其他分析领域，可实现对抗生素的快速、灵敏和现场检测。
江苏海洋大学王淑军教授团队在期刊Sensors上发表了最新研究，他们首先利用指数富集配体进化技术(SELEX)技术筛选了氧氟沙星特异性适配体，适配体AWO-06对氧氟沙星表现出高度的亲和力和特异性。然后以AWO-06作为探针和氧化石墨烯(GO)作为淬灭剂，开发了一种荧光生物传感器用于氧氟沙星检测。研究发现，当氧氟沙星的浓度在10-300 nM范围内时，其与产生的荧光强度呈线性关系，并测定传感器的检测限为0.61 nM。本研究中开发的生物传感器操作简单，反应迅速，适用于现场检测。
图1：(A) 适体筛选期间的回收率;(B)氧化石墨烯浓度优化;(C)候选适配体的Kd和二级结构预测图;(D) AWO-06特异性测定。
12轮磁珠SELEX筛选完成后，通过高通量测序共获得169,603个适体序列。使用IDT OligoAnalyzer 3.1软件确定了高富集率序列的二级结构以及预测的吉布斯自由能。适配体序列主要由茎环和发夹结构组成，GC含量高(图1C)。这些结构的存在使适配体能够特异性识别氧氟沙星。基于二级结构和吉布斯自由能，选择了6个序列作为候选适配体(AWO-01、AWO-02、AWO-03、AWO-04、AWO-05和AWO-06)。这些适配体在其5'端用FAM标记并合成。随后对GO浓度进行了优化，荧光信号随着GO浓度的增加而逐渐变弱(如图1B)。在GO浓度为30 µg/mL时，荧光强度保持稳定。因此，后续实验中使用的GO浓度为30 µg/mL。通过测量荧光强度绘制非线性拟合曲线估计了6个候选适配体的Kd值。图1C显示AWO-06的最低Kd (28.16 nM)。此外，通过使用罗红霉素(CCR)、苯唑西林(OXA)、氯霉素(CPL)、磺胺嘧啶(SD)、青霉素G(PG)、妥布霉素(TOB)和氨苄青霉素(APR)作为氧氟沙星的对照，使用超纯水作为空白，分析了候选适体AWO-06的选择特异性。结果表明，候选适配体AWO-06对氧氟沙星产生了强荧光信号，显示了其对氧氟沙星的选择性特异性(图1D)。从本研究中得出的解离常数比先前报道的氧氟沙星的Kd更小。综上，AWO-06与氧氟沙星具有高度的亲和力和特异性。
图2：(A) 传感器可行性分析:(A)传感器设计，(b)荧光比色图;(B)传感器灵敏度;(C)传感器特异性;(D)传感器稳定性。
当氧氟沙星被添加到传感器中，传感器产生了强烈的荧光信号。而当没有氧氟沙星时，观察不到荧光信号，这证明了该传感器的可行性(图2A)。本研究中使用5-700 nM的氧氟沙星来分析传感器的灵敏度。随着氧氟沙星浓度的增加，传感器的荧光强度逐渐增加(图2B)。非线性拟合曲线显示，在10-300 nM范围内，氧氟沙星和荧光强度之间存在良好的线性关系，检测极限为0.61 nM。随后，通过测量传感器的荧光强度来计算∆F，并通过观察传感器在蓝光辐射下的荧光图像来确定传感器的特异性(图2B)。如图2C所示，该传感器对氧氟沙星具有高度特异性，而对其他抗生素的信号相对较低甚至不存在。最后，确定传感器的稳定性(图2D)。根据荧光强度图和荧光显色图来看，加入了糖防腐剂的传感器更稳定，识别氧氟沙星的能力更好。接着对传感器在室温下存储0-3个月后的性能进行了测试。观察到传感器在第一个月最有效。然而，即使在储存3个月后，也能观察到良好的荧光反应。实验表明所研制的传感器可以长时间存储。
本研究使用磁珠SELEX技术对从随机ssDNA文库筛选氧氟沙星适配体，AWO-06被发现是最佳候选适配体，Kd为28.16 nM。经过对适体的特异性进行分析，结果证明适体对氧氟沙星表现出高度特异性。接着使用基于GO的荧光定量方法开发了一种适配体生物传感器，实现了对氧氟沙星快速、灵敏的检测。设计的传感器展现出出色的灵敏度和特异性，使其能够在样品和适配体反应仅6分钟后便检测到氧氟沙星的存在。该传感器在实际肉类样品中表现出良好的检测性能，其检测限为8.76 nM。此外，该传感器能够在室温下长时间储存，经过3个月的存储后仍然保持良好的稳定性。这种开发的传感器有望广泛应用于动物家畜和水产养殖业，可以快速检测肉制品中的氧氟沙星残留物，具有巨大的潜在应用前景。
论文信息：doi:10.3390/s24061740.
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