土壤和环境中的脲酶与农业氮肥的损失和微生物的氨排放有关。因此，脲酶的监测对于生物分析和环境安全都非常重要。纳米酶不仅具有蛋白酶的催化特性，还具有天然酶所不具备的易储存、耐高温、易修饰、成本低等特点。在医学诊断、临床治疗、生物分析、环境监测、农业生产等方面有着广泛的应用。目前，已基于对天然酶的结构认知开发出多种纳米酶。
图1：(A)基于Cu@Zr级联反应的脲酶检测多模式传感示意图；(B)基于Cu@Zr磷酸酶和漆酶双酶性质的级联反应示意图。
图1展示了基于Cu@Zr的磷酸酶和漆酶活性开发的一种级联传感器。底物PPDS的P−O键被Cu@Zr的磷酸酶活性裂解，产生无色苯酚，苯酚被Cu@Zr的漆酶活性氧化并与4-AP(4-氨基安替比林，显色剂)络合产生红色QI(醌亚胺)；其吸光度为505 nm。脲酶水解尿素产生的NH3增强了Cu@Zr的催化活性，进一步导致505 nm处的吸光度增加。Cu@Zr相应的荧光通过内滤光效应(IFE)被产生的QI猝灭。因此，通过使用Cu@Zr的双酶级联传感器建立了脲酶分析的双模式策略，借助智能手机的RGB读取功能用于脲酶的便携式原位检测。
研究人员通过简单的自组装过程将两种纳米酶复合在一起，制备出具有双重酶活性的Cu@Zr(图2A)。首先，以铜离子、氨基对苯二甲酸(NH2-BDC)和组氨酸(His)为原料，通过水热合成得到具有漆酶活性的Cu-BH，以ZrCl3和对苯二甲酸(H2BDC)为原料，通过水热和碱处理合成具有磷酸酶活性的ZrOx−OH。随后通过在室温下搅拌获得的Cu-BH和ZrOx-OH生成Cu@Zr。合成的Cu@Zr实现了集双酶活性于一体的综合工艺，生成了具有更高效率和多功能性的新材料。
图2：(A) Cu@Zr自组装合成示意图；(B) Cu-BH、(C) ZrOx−OH和(D) Cu@Zr的SEM图像；(E) Cu@Zr的元素图。
该团队进一步研究了Cu@Zr的催化活性。如图3A所示，Cu@Zr的自组装合成表现出类似天然漆酶和磷酸酶的双重酶活性。Cu@Zr可以裂解PNPP的磷氧键，产生黄色PNP(4-硝基苯酚) 产物，在405 nm处具有明显的吸光度峰(图3B)。为了进一步研究Cu@Zr的催化性能，测定了不同CPNPP作为底物的动力学参数。如图3E、F所示，根据Michaelis−Menten方程的拟合，Vmax为7.54 μM/min，Km为0.39 mM，表现出优异的底物亲和力和反应速率。
对 Cu@Zr 的类漆酶活性进行了进一步研究。图3H显示Cu@Zr和天然漆酶可以催化2,4-DP的氧化，其氧化产物与4-AP反应生成红色醌亚胺，在510 nm处有强吸收峰。与天然漆酶相比，相同质量的Cu@Zr在室温下反应时在510 nm处表现出更高的吸光度峰。同时，图3E,F也显示了Cu@Zr以2,4-DP为底物的优良动力学特性。因此，Cu@Zr 卓越的双重酶活性为生化和环境分析提供了有利的潜力。
图3：(A) Cu@Zr的双酶活性说明；(B) Cu@Zr磷酸酶活性的可行性；(C) 不同Cu@Zr浓度下磷酸酶活性随时间的变化曲线；(D) Cu@Zr催化不同浓度PNPP的谱图；(E)动力学曲线和(F)Cu@Zr以PNPP和2,4-DP为底物的动力学线性关系；(G) 基于Cu@Zr双酶活性的pH优化；(H) Cu@Zr漆酶活性的可行性；(I)不同浓度Cu@Zr下漆酶活性随时间的变化曲线。
研究人员以PPDS为底物建立了级联反应。最初，基于Cu@Zr的磷酸酶活性，底物PPDS的磷-氧键被裂解，产生苯酚产物。反过来，生成的苯酚在Cu@Zr的漆酶活性催化下产生氧化中间体。然后，氧化中间体与显色剂4-AP 结合，生成红色的醌亚胺，在505 nm波长处具有明显的吸光度峰。同时，生成的醌亚胺还能淬灭Cu@Zr在440 nm波长处的蓝色荧光。图4B展示了级联反应的可行性。据观察，仅在Cu@Zr、PPDS和 4-AP存在的情况下，Cu@Zr 440 nm处的蓝色荧光才会显着猝灭。这说明荧光信号可以用作所建立的级联反应中的第二输出信号。Cu@Zr+PPDS+4-AP的吸光度峰与Cu@Zr的荧光发射峰有很大的重叠，而它们的荧光寿命几乎保持不变(图4E,F)，这推断IFE 是荧光猝灭的主要贡献者；因此，Cu@Zr双酶级联反应的可行性和机理得到了有效论证。
图4：(A) Cu@Zr基双酶级联反应示意图；(B) Cu@Zr基双酶级联反应的可行性分析；(C) 基于Cu@Zr级联反应的不同浓度PPDS的紫外光谱；(D) 基于Cu@Zr级联反应的不同浓度PPDS的荧光光谱和照片；(E) Cu@Zr+PPDS+4-AP的紫外吸收光谱和Cu@Zr的荧光发射光谱；(F) Cu@Zr和Cu@Zr+PPDS+4-AP的荧光寿命图。
在优化条件下当脲酶浓度在15至550 U/L之间时，505 nm处的吸光度随着脲酶浓度的增加而呈上升趋势(图5A)，吸光度比值与尿素酶浓度呈良好的线性关系(图5C)。计算出检测限(LOD)为 3.56 U/L。基于荧光信号通路也可以建立脲酶的定量分析。如图5B、D所示，440 nm处的荧光比随着脲酶浓度(10−500 U/L)的增加而降低，LOD为1.83 U/L。图5E表明用Cu@Zr建立的脲酶检测策略具有较高的特异性选择性。如图5F所示，常见无机盐(绿色)、糖嘞(黄色)、氨基酸(紫色)、偶氮化合物(红色)和500 U/L的蛋白酶(蓝色)与脲酶(350 U/L)共存时，比色和荧光信号均不受影响，这表明所提出的脲酶测定法具有优越的抗干扰性能。这些结果表明，所提出的Cu@Zr级联传感器在脲酶检测方面表现出出色的准确性和精密度。
图5：(A) 基于Cu@Zr的脲酶比色测定的吸收光谱；(B) 基于Cu@Zr的脲酶荧光测定的荧光光谱；(C)脲酶线性关系曲线的相应比色分析；(D)相应荧光分析脲酶的线性关系曲线；(E) 脲酶定量的选择性；(F)脲酶定量的抗干扰性。
在实际应用中，克服传统分析方法操作复杂、携带不便的弊端，建立简单、方便的分析方法至关重要；因此，基于Cu@Zr级联反应构建了用于脲酶分析的便携式拭子策略(图6)。首先，在试管中加入脲酶并孵育50分钟，然后将拭子和1 mg/mL的4-AP显色剂混合，在试管中反应60分钟，之后试管中的颜色明显从无色变为粉红色。随后，用智能手机捕捉拭子的颜色，并直接记录相应颜色的RGB值。
图6：基于Cu@Zr用于脲酶检测的便携式棉签流程图。
DOI：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04652
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