葡萄糖是人类生命活动的主要能量来源，开发简单、准确、灵敏的葡萄糖检测方法来评估其浓度至关重要，这对于识别营养成分和监测人类的身体状况具有重要意义。目前的葡萄糖传感方法主要依赖于天然酶。然而由于成本高和不稳定的问题，极大地限制了它们的应用。与天然酶相比，纳米酶通常表现出较差的选择性。因此，提高纳米酶的选择性是制备传感器不可避免的问题。制备纳米酶的材料主要是金纳米颗粒（Au NPs）和金纳米团簇。基于Au NPs的纳米酶结构稳定，易于制备，因此具有很强的类葡萄糖氧化酶（GOx）活性，更适合作为葡萄糖检测的传感探针。然而其成本高，催化活性低且选择性差。分子印迹技术是在纳米酶表面构建人工识别位点以赋予纳米酶高度选择性的有力工具。
青岛大学许元红教授在顶级期刊Biosensors and Bioelectronics上发表了题为Highly selective nanozyme-based glucose sensing platform via construction of artificial recognition sites on gold nanospheres的研究成果。以聚多巴胺纳米颗粒（PDA NPs）为支撑平台，通过将Au NPs固定在PDA NPs表面，成功获得了PDA-金纳米颗粒（PDA@Au NPs）。以葡萄糖和硼酸衍生物为模板和功能单体，在PDA@Au NPs表面制备分子印迹聚合物（MIPs），得到选择性明显增强的分子印迹纳米酶（PDA@Au NPs-MIPs）。
图1：(A)逐步制备PDA@Au NPs的示意图。(B) PDA NPs、(E) PDA@Au NPs的SEM图像。(C) PDA NPs、(F) PDA@Au NPs的TEM图像。(D) PDA NPs、(G) PDA@Au NPs的SEM映射图像。
图1A显示了PDA NPs和PDA@Au NPs的合成机理和过程。通过多巴胺在碱性条件下自聚合合成PDA NPs，然后通过氯金酸还原制备AuNPs，并均匀固定在PDA NPs表面。然后分别通过SEM和TEM表征它们的形态。结果表明Au NPs已成功固定在PDA NPs表面。
图2：(A)、(B) PDA@Au NPs的HRTEM图像。(C) PDA@Au NPs和PDA NPs的XRD图。(D) PDA NPs和PDA@Au NPs的FT-IR光谱。(E) PDA NPs的XPS勘测光谱。(F) PDA@Au NPs 的XPS光谱。
图2C显示了PDA NPs和PDA@Au NPs的XRD图谱，其中PDA NPs的典型面包峰通常被认为是无定形聚合物材料的特征峰，这些峰的存在证明PDA NPs已经成功制备。如图2A和B所示，HRTEM也证明了Au NPs的成功合成。以上结果均证明Au NPs已成功制备并固定在PDA NPs表面。图2D所示的FTIR光谱进一步证实了PDA NPs的成功合成。根据PDA NPs和PDA@Au NPs的XPS测量谱，如图2E和F所示证明了PDA@Au NPs的成功制备。
图3：(A) 基于显色反应的葡萄糖酸检测机理示意图。(B) 添加PDA@Au NPs后葡萄糖溶液的紫外可见光谱。(C)不同pH下所得PDA@Au NPs的类GOx催化活性。(D) PDA@Au NPs和不同浓度的葡萄糖存在下的溶液。
如图3A所示，使用PDA@Au NPs作为传感探针，通过检测产物葡萄糖酸实现一步式葡萄糖传感，从而显著简化了操作流程并提高了检测效率。在典型的传感过程中，将NH2OH和Fe3+依次添加到含有葡萄糖酸的溶液中，然后测试所得混合物的紫外吸收光谱。如图3B所示，450-550 nm处的明显吸收带证明了葡萄糖酸的存在，表明PDA@Au NPs可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸。另一种产物H2O2通过酶比色法和荧光铕四环素络合物 (EuTc) 进行检测。所制备的PDA@Au NPs具有明显的类似GOx的催化活性。
图4：PDA@Au NPs的催化活性测试。(A) 添加PDA@Au NPs后葡萄糖溶液的紫外可见光谱。(B) 505 nm处的吸光度强度与葡萄糖浓度之间的线性关系。(C) 在不同干扰下测试PDA@Au NPs的选择性测定。(D) 干扰测试，通过表征PDA@Au NPs在含有混合单糖的溶液中的级联催化活性来进行。
为了提高灵敏度，在最佳工作条件下进行比色试验，观察到明显的线性关系，如图4A所示，在10 μM至1 mM范围内，随着葡萄糖浓度的增加，紫外吸光度值呈线性增加。并对图4B所示数据进行线性拟合，得到的线性方程为y=7.68E−5x+0.0761，R2=0.994。所制备的葡萄糖传感器的LOD为0.295 μM。所提出的传感方法无需复杂的仪器，肉眼就能清楚地区分颜色变化。为了验证制备的传感器的选择性，选择了尿液和血清中的一系列糖类和其他干扰物质来判断它们是否能被PDA@Au NPs催化。如图4C所示，纳米酶对木糖的催化活性几乎与对葡萄糖的催化活性相同。显然，所制备的传感器选择性较差，图4D中的测试结果进一步证明了这一点。
图5：(A) PDA@Au NPs-MIPs逐步合成的示意图。(B)三(4-乙烯基苯基1)硼氧烷的1H NMR谱，(C)功能性单体(化合物a)的1H NMR谱。(D) 所制备的 PDA NPs、PDA@Au NPs和 PDA@Au NP-MIPs的XRD图谱。(E) PDA@Au NPs 和 PDA@Au NPs-MIPs的FT-IR光谱。(F) PDA@Au NPs-MIPs的XPS勘测光谱。(G) PDA@Au NPs和PDA@Au NPs-MIPs的Au 特征峰强度比较。
图5A显示了MIPs在PDA@Au NPs表面的逐步构建。合成MIPs的第一步是制备用于葡萄糖印迹的功能单体。使用DMSO-d6作为氘代溶剂获得三(4-乙烯基苯基1)硼氧烷和功能单体(化合物a)的1H NMR谱，图5B和C中显示的结果证实了化合物a的成功合成，它是后续研究中构建分子印迹聚合物的重要中间体。然后，AIBN引发交联聚合形成交联聚合物并包裹在PDA@Au NPs的表面。去除模板葡萄糖后，产生具有结合位点的MIPs，并赋予PDA@Au NPs特异性识别葡萄糖的能力。在PDA@Au NPs表面构建的聚合物层形成了相当复杂的交联三维网络结构。
图6：(A) PDA@Au NPs和PDA@Au NPs-MIPs的催化活性测试。(B) 葡萄糖检测和拟合曲线。(C) PDA@Au NPs-MIPs对多种单糖的选择性测试。(D) 通过分析PDA@Au NPs-MIPs在含有混合单糖的工作溶液中的催化活性进行干扰测定。(E) PDA@Au NPs-MIPs的循环性能测试。(F) PDA@Au NPs-MIPs在30天内的长期稳定性。
对压印前后纳米酶对葡萄糖催化活性的变化进行了表征，相关结果如图 6A 所示。结果表明，与PDA@Au NPs的催化活性相比，PDA@Au NPs-MIPs的催化活性只有轻微的下降。分子印迹后的线性检测曲线方程为y=5.92 E-5*x+0.06646（R2=0.995），葡萄糖的检测浓度范围为10 μM-1 mM，LOD为0.227 μM（S/N=3）（图 6B），经测定，分子印迹后传感器的检测限和线性范围与印迹前的水平保持一致。然后，还研究了PDA@Au NPs-MIPs对不同单糖的选择性测试。分别对溶解有相同浓度的葡萄糖、甘露糖、木糖和果糖的工作溶液进行505 nm处的紫外-可见光吸收表征。吸光度差异如图6C所示，尿液和血清中含有其他单糖（甘露糖、木糖和果糖）和其他干扰物质的溶液的吸光度强度远低于葡萄糖。这表明PDA@Au NPs-MIPs的选择性比PDA@Au NPs好得多（图4C）。如图 6D 所示，与原始PDA@Au NPs相比，PDA@Au NPs-MIPs对多种干扰物质的抗干扰能力明显提高（图 4D）。PDA@Au NPs-MIPs选择性的增强表明了MIPs在特异性葡萄糖识别方面的有效性。
DOI：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116169
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