1月16日，赛业生物体外药效高级科学家吴强博士主讲「稳转功能细胞系如何助力药物筛选」线上课程，以下为本次直播常见问题汇总与解答。
FAQ:
1.什么是稳转细胞系？
2.病毒载体的种类和优势？
3.稳转细胞最多可用几代？
4.如何获得高纯度稳转细胞？
5.细胞药筛流程？
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什么是稳转细胞系？
稳转细胞系是通常涉及基因工程技术来创建可以稳定表达特定外源基因的细胞系。
稳转细胞系的建立：通过将目标基因插入到载体中，并利用该载体将基因导入宿主细胞内，经过筛选和扩增后，获得能够长期稳定表达外源基因的细胞群体。这需要使用适当的选择标记来确保只有成功整合了外源DNA的细胞才能存活并被挑选出来。
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Q
病毒载体的种类和优势？
1. 慢病毒（Lentivirus）载体：
特点：能够高效感染分裂和非分裂细胞，具有较高的基因传递效率和稳定的长期表达特性。
优势：特别适合难转染的细胞，如原代细胞、干细胞等，并且可以实现定点整合。
2. 逆转录病毒（Retrovirus）载体：
特点：适用于快速分裂的细胞，整合效率较高，但不能有效感染非分裂细胞。
局限性：由于其整合机制，存在一定的插入突变风险。
3. 腺相关病毒（AAV）载体：
特点：低免疫原性和较好的组织特异性，常用于体内实验，尤其是需要特定组织表达的情况下。
局限性：虽然可以实现长时间表达，但整合效率较低，更多依赖于游离形式的DNA复制。
4. 腺病毒（Adenovirus）载体：
特点：能够高效感染多种类型的细胞，包括非分裂细胞。
局限性：主要是瞬时表达，长期稳定性较差，而且可能引发较强的免疫反应。
A
Q
稳转细胞最多可用几代？
稳转细胞株的传代次数并没有一个固定的上限，理论上可以在适当的条件下无限次传代。然而，实际操作中存在一些因素会影响稳转细胞株的稳定性和表现：
1. 基因组稳定性
随机整合的影响：如果外源基因是通过随机整合到宿主基因组中的，那么随着传代次数增加，可能会出现插入位点附近基因表达的变化，甚至可能导致外源基因沉默或丢失。
定点整合的优势：使用CRISPR/Cas9等基因编辑工具进行定点整合可以提高基因组稳定性，减少上述问题的发生。
2. 选择压力的维持
持续的选择标记表达：为了确保所有细胞都携带外源基因，在传代过程中通常需要继续施加选择压力（如抗生素）。如果选择标记的表达水平下降，未携带目标基因的细胞可能会重新生长出来，影响细胞株的纯度。
定期筛选：即使在长期培养后，也应定期重新筛选细胞，以确保所有细胞仍然保持对外源基因的选择性优势。
3. 细胞健康与老化
细胞衰老：随着传代次数的增加，细胞可能会逐渐进入衰老状态，表现为增殖速度减慢、形态改变等。这种情况下，细胞对实验条件的变化更加敏感，可能影响实验结果的一致性。
遗传漂变：长时间传代还可能导致细胞发生自发突变或染色体异常，进而影响其生物学特性。
A
Q
如何获得高纯度稳转细胞？
1. 优化载体设计
选择强启动子：使用高效的启动子来驱动外源基因表达，可以增加成功转染后基因表达的概率。
2. 高效转染方法
电穿孔或脂质体转染：选择适合目标细胞系的高效转染方法，如电穿孔或高质量的脂质体转染试剂
病毒转导：对于难以转染的细胞类型，考虑使用慢病毒或其他类型的病毒载体进行转导，以提高转染效率。
3. 严格的选择压力
逐步增加选择药物浓度：从较低浓度开始施加选择压力，逐渐增加至最终工作浓度，避免一次性加入过高浓度导致细胞过度死亡。
维持适当的选择压力时间：给予足够的时间让未转染细胞完全被筛选掉，但同时也要监测细胞健康状态，防止长时间选择造成细胞损伤。
4. 单克隆分离
有限稀释法：将细胞稀释到极低密度，使得每个孔内只有一个细胞，然后培养成独立的克隆。这种方法是获得单一来源细胞株的经典方式。
流式细胞术分选（FACS）：如果载体中含有荧光报告基因（如GFP），可以通过FACS直接挑选表达该报告基因的单个细胞，这不仅提高了纯度，还加快了筛选速度。
软琼脂克隆形成法：适用于悬浮生长的细胞，通过在软琼脂中培养，仅允许单个细胞形成克隆，从而实现单克隆分离。
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Q
细胞药筛流程？
1. 确定药物种类：应根据载体携带的抗性基因来选择，例如neo(G418), puro(puromycin),hygro(hygromycin)等。
2. 浓度梯度预实验：设定一系列浓度梯度，在目的细胞上进行预实验，以便获得最佳药物浓度和筛选时间。
3. 接种细胞：细胞汇合度最好在50%~80%左右，确保细胞状态良好，处于对数生长期。
4. 药物筛选：药物稀释到合适的浓度加到细胞培养基，根据预实验结果设定合理的药物处理时间。需要同时设置WT对照孔以便观察药筛效果。
5. 半药维持：待WT对照孔的细胞完全死亡时药筛完成，可以进行下一步操作。后续培养过程中可添加一半浓度的药维持培养。
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