Cel Mol Immun(IF=21.5)︱UBXN6在脓毒症的免疫抑制环境中发挥重要作用

文摘   2024-12-29 08:01   广东  

脓毒症是一种危及生命的全身性炎症反应综合征。炎症与先天免疫之间的微妙平衡对于有效协调保护性免疫反应以防止病原体入侵至关重要。了解单核细胞/巨噬细胞调节炎症和先天免疫的机制,有助于开发脓毒症等炎症性疾病的新型疗法。


含缬酪肽蛋白(VCP,又称为p97)是与多种细胞活动相关的ATP酶(AAA+)超家族中的重要成员,可调节自噬、内质网相关蛋白降解、基因表达等过程,从而维持细胞稳态。超过40个辅因子与p97相互作用,通过促进底物招募参与其功能调节。UBX结构域蛋白6(UBXN6)是一种新发现的p97辅因子,但它在先天免疫系统中的作用仍知之甚少。


韩国忠南大学和全南大学等机构的研究人员近日深入探索了UBXN6与脓毒症的关联。他们发现,UBXN6在脓毒症发生时可作为自噬的激活剂,并调节炎症以维持免疫系统的抑制。这项研究成果于2024年10月23日发表在《Cellular & Molecular Immunology》期刊上,有望助力脓毒症新型疗法的开发。


图片来源:《Cellular & Molecular Immunology》

(https://doi.org/10.1038/s41423-024-01222-1


研究材料与方法

在这项研究中,研究人员采用批量细胞RNA测序和单细胞RNA测序技术对脓毒症患者以及对照的血液样本进行分析。为了探索UBXN6的功能,他们将Ubxn6flox/flox小鼠(由赛业生物提供)与Lyz2Cre小鼠杂交,构建了髓系特异性UBXN6缺陷型(cKO)小鼠,并对cWT和cKO小鼠的骨髓来源巨噬细胞(BMDM)开展了分析。他们还通过非靶向代谢组学分析研究了cWT和cKO BMDM之间的代谢差异。


技术路线

01

通过深度RNA测序技术比较脓毒症患者及对照的基因表达差异,发现UBXN6在脓毒症患者体内上调

02

构建髓系特异性UBXN6 cKO小鼠,在体外分析UBXN6对炎症反应和自噬的影响

03

通过非靶向代谢组学分析研究UBXN6如何影响免疫代谢

04

利用cKO小鼠开展体内研究,进一步确认UBXN6是否控制炎症


研究结果

1

UBXN6在脓毒症患者中上调

为了研究脓毒症患者的基因表达整体变化,研究人员首先用深度RNA测序技术对预后不良患者(SP)、康复患者(SR)和健康对照(HC)的外周血单核细胞(PBMC)进行了转录组分析。在比较各组间的差异表达基因(DEG)后,他们发现SP患者下调的DEG主要集中在与免疫系统相关的生物学过程,表明这些患者表现出免疫抑制特征。


在深入分析自噬相关基因的表达谱后,他们发现UBXN6、FBXO7等基因的表达在SR和SP患者之间表现出显著差异。后续分析重点关注了UBXN6,因为它与炎症细胞因子相关信号通路的调控相关。结果显示,UBXN6在人类脓毒症患者中上调,其水平与炎症基因的表达呈负相关,但与FOXO3等自噬相关基因的表达呈正相关。


2

UBXN6是炎症反应的关键调节因子

为了深入了解表达UBXN6的细胞类型,研究人员开展了单细胞RNA测序实验。他们发现,UBXN6主要在单核细胞/巨噬细胞中表达,而不是在T细胞或B细胞中表达(图1)。于是,他们将Ubxn6flox/flox小鼠(由赛业生物提供)与Lyz2Cre小鼠杂交,构建了髓系特异性UBXN6缺陷型(cKO)小鼠。


之后,他们利用LPS刺激小鼠的BMDM,并开展了批量细胞RNA测序分析。热图分析显示,与cWT BMDM相比,cKO BMDM中的一些促炎细胞因子(包括Tnf和Il18)以及趋化因子(包括Ccl3、Ccl4和Ccl5)表达水平更高(图1)。此外,UBXN6缺失调节了NLRP3炎性体的激活。这些结果表明,UBXN6对调节各种先天免疫信号通路触发的炎症反应至关重要。


图1 UBXN6的髓系表达可控制LPS诱导的促炎反应[1]


3

UBXN6在诱导自噬和ERAD方面发挥关键作用

接下来,研究人员分析了UBXN6在自噬中的作用。在暴露于各种自噬刺激时,cKO BMDM和转导shUBXN6的人类原代单核细胞会出现LC3斑点的显著丢失。此外,在LPS刺激后,cKO BMDM中观察到的自噬体数量大大低于cWT BMDM。在采用自噬抑制剂Baf-A1处理后,cKO BMDM的LC3-II/ACTB比例显著降低,表明自噬诱导受阻。这些数据表明,UBXN6在诱导自噬方面起着关键的作用。


为了确定UBXN6是否调控内质网相关蛋白降解(ERAD)通路,研究人员分析了cWT和cKO BMDM在LPS和SMER28作用下的ERAD相关基因(包括Sel1l、Edem1、Syvn1等)。与cWT BMDM相比,cKO BMDM中所有基因的表达水平都显著降低。此外,在LPS刺激后,cKO BMDM中的SEL1L和SYVN1蛋白水平也显著下降。由此可见,UBXN6对先天免疫刺激后激活ERAD很重要。


自噬和ERAD的缺陷与线粒体功能障碍有关,导致mtROS的积累。因此,他们进一步研究了cWT和cKO BMDM中的mtROS水平。与cWT细胞相比,cKO BMDM中UBXN6的缺失会显著增加LPS诱导的mtROS生成。利用mtROS抑制剂MitoTEMPO处理后,cWT和cKO BMDM中的炎症细胞因子和趋化因子表达水平显著降低。这些结果表明,髓系UBXN6通过调节线粒体氧化应激,在诱导自噬和ERAD方面发挥关键作用。


4

UBXN6缺失诱导免疫代谢重塑

为了探索UBXN6是否会影响炎症期间的免疫代谢,研究人员通过非靶向代谢组学分析研究了cWT和cKO BMDM之间的代谢差异。UBXN6缺失导致乳酸/丙酮酸比例显著升高。在LPS刺激下,cKO BMDM的细胞外酸化率(ECAR)明显增加,编码有氧糖酵解关键基因Hif1a和Ldha的mRNA水平也显著升高(图2)。由此可以看出,巨噬细胞中UBXN6的缺失会促使免疫代谢转向有氧糖酵解。


非靶向代谢组学分析还发现,在未处理的条件下,cKO BMDM的支链氨基酸(BCAA)水平明显增加,包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。有趣的是,在LPS处理前后的所有时间点,cKO BMDM中的支链氨基酸浓度都显著升高(图2)。后续的分析表明,髓系UBXN6的缺失可能是通过L型氨基酸转运蛋白的表达失调来驱动有氧糖酵解和支链氨基酸的积累。


图2 UBXN6缺陷型巨噬细胞的必需氨基酸水平升高,有氧糖酵解增加[1]


之前的研究表明,细胞中支链氨基酸水平的升高会通过激活mTOR复合物1(mTORC1)来促进炎症反应。于是,研究人员分析了AMPK和mTOR信号通路的激活状态。在LPS刺激下,cKO BMDM中磷酸化mTOR激酶和核糖体蛋白S6激酶1的水平显著升高。此外,他们还发现,cKO BMDM中转录因子TFEB的核转位以及下游自噬基因的表达在LPS处理后显著降低,TFEB是溶酶体再生和生成的调节因子。这些结果表明,UBXN6通过激活mTOR-TFEB信号通路促进溶酶体生成。


5

髓系UBXN6是体内控制炎症所必需的

为了确定UBXN6是否在体内控制炎症,研究人员对cWT和cKO小鼠进行了LPS刺激。与cWT小鼠相比,cKO小鼠对LPS诱导的死亡率表现出更高的易感性(图3),表明髓系UBXN6缺失导致的严重炎症会带来致命后果。与cWT小鼠相比,cKO小鼠的肺和脾出现了更多的炎症反应(图3)。cKO小鼠在急性肺损伤后,肺组织中的肿胀线粒体比例明显增加。这些结果表明,先天免疫细胞中的UBXN6对控制炎症反应至关重要。


图3 UBXN6可减轻脓毒症诱导的死亡和全身性免疫反应[1]


研究结论

总的来说,这项研究首次发现髓系UBXN6在协调自噬、内质网相关蛋白降解以及免疫代谢方面发挥重要作用,从而影响巨噬细胞的线粒体稳态和炎症。此外,这些研究结果还强调了在脓毒症发生时UBXN6对免疫抑制的重要性,表明靶向UBXN6的新型疗法对全身性炎症患者具有潜在的治疗效果。


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参考文献:

[1]Kim, Y.J., Lee, SG., Park, S.Y. et al. Ubiquitin regulatory X (UBX) domain-containing protein 6 is essential for autophagy induction and inflammation control in macrophages. Cell Mol Immunol (2024). https://doi.org/10.1038/s41423-024-01222-1


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