12月12日，赛业生物细胞基因编辑生产经理范丽莉&赛业OriCell业务产研中心负责人曹汐&赛业OriCell产品应用科学家黄增慷博士主讲「干细胞研究关键技术及前沿视角」线上课程，以下为本次直播常见问题汇总与解答。
FAQ:
1.iPSC基因编辑的难点和注意事项？
2.如何判断细胞是否成功重编程成了iPSC？有哪些标志物可以帮助我们进行早期检测？
3.如何提高原代细胞爬出效率？
4.原代细胞的基因编辑方法？
5.获取外泌体数量和细胞数量的关系？
6.赛业的原代细胞为什么提供P2，不是P0？小鼠BMSC是P6，收到需要马上实验吗？
7.如何避免BMSC细胞老化问题，细胞到后期会变“胖”？
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Q
iPSC基因编辑的难点和注意事项？
iPSC基因编辑的难点有基因编辑效率低、细胞培养过程中容易分化和单克隆形成率低。
针对以上难点的解决方案和注意事项有：
1.选择合适的基因编辑方案至关重要。赛业生物的智能化系统可以对基因进行全面分析，包括致死性、拷贝数和表达水平等多维度评估提升项目成功率。
2.iPSC转染困难也会导致基因编辑效率低，建议选择温和转染方法保证效率同时也要确保细胞活率。
3.iPSC培养过程中容易分化，需要注意提供合适的培养系统、良好的生长环境、操作轻柔等防止iPSC分化。
4.单克隆形成率低，iPSC呈克隆团生长，单克隆不易形成，注意选择合适的消化液将iPSC克隆团消化成单个细胞，接着选择适合的单克隆制备方案提升单克隆形成率。
A
Q
如何判断细胞是否成功重编程成了iPSC？有哪些标志物可以帮助我们进行早期检测？
通过形态，标志物、遗传稳定性和分化潜能等方面进行初步判段iPSC是否构建成功。
1.理想的iPSC细胞形态呈克隆团生长，克隆边缘清晰，核质比高，形态均一、克隆内细胞与细胞之间接触紧密。
2.通过流式，qPCR或免疫荧光进行检测iPSC标志物TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-4、OCT4、SOX2等。
3.染色体核型和STR验证遗传稳定性。
4.体外三胚层分化或畸胎瘤实验验证iPSC的分化潜能。
A
Q
如何提高原代细胞爬出效率？
在原代细胞取材过程中我们确实常碰到P0代细胞从组织块中“爬”出缓慢，或者发现贴壁的细胞有明显不同形态即存在杂细胞污染问题。
此时我们可以尝试以下几种方法：
1.尽可能去除不需要的组织。比如在脐带间充质干细胞取材过程中，需要完全去除血管组织，因为其中的血管内皮细胞和成纤维细胞经常比目标细胞更早“爬”出组织块，造成后期无法完全去除。
2.细胞在组织内的迁移能力非常有限，所以要细胞迅速迁移出组织块就需要尽可能破碎组织。但破碎组织的过程中极易损伤细胞，所以方法至关重要。常用的方法有机械剪切、酶消化、研磨等。需要注意，对于需要获取后用于培养的细胞，除了肝脏、脾脏等少数组织较松散的器官，其他组织尽量不要使用研磨的方式；
3.在接种小组织块之前，可以在培养瓶、皿内预包被明胶、基质胶等，以辅助组织块贴附。接种组织后尽可能长时间不要碰触、移动培养容器，这一点是极易被忽视的关键。
A
Q
原代细胞的基因编辑方法？
不同于永生化的细胞系，原代细胞受制于取材方法、培养操作和自身有限的活力及增殖能力，对其基因编辑难度普遍高于永生细胞系。
首先，原代细胞普遍较脆弱，电穿孔转染质粒的方法常表现出对其活力伤害较大。所以我们常用化学转染法（如脂质体）以及病毒载体（如慢病毒、腺病毒）来转染原代细胞。需要注意，不合适的脂质体和病毒转染MOI（转染复数）也常表现出对细胞的伤害。其次，原代细胞普遍不能支持获取基因编辑纯合子。目前的各类外源基因转染方案在本质上依然依赖概率，即没有一种方法可以确保一次性对实验组所有细胞成功转染或者编辑细胞内目标基因的所有拷贝。所以通常想要获取纯合的基因编辑细胞株，需要在转染了外源基因的细胞群中通过单克隆或药物筛选的方法获取纯合基因编辑株。但原代细胞相对孱弱的增殖和单克隆增殖能力，决定了无法支持这样的操作。
所以想要编辑原代细胞需要充分了解细胞生长特性和各转染方法的优缺点，做合理搭配，也做好预期管理。
A
Q
获取外泌体数量和细胞数量的关系？
在回答这个问题前，我们需要达成一个共识，即我们获取的外泌体是我们需要的而不是细胞分泌的所有外泌体。
受制于目前获取和纯化外泌体的技术，我们没有办法从细胞时刻分泌的众多外泌体中准确获取我们关注的部分，甚至我们没有办法准确去除细胞的代谢废物，它们通常也会“伪装”成外泌体的样子，分泌到培养环境中。理论上，其他条件一致，细胞数量越多我们能获取的外泌体总量也一定会更多。但这些“外泌体”很可能并不是我们需要的，或在下游功能实验中表现不佳或不稳定。
所以，相对于细胞数量，我们更应该关注细胞培养条件（实验方案）、细胞生长状态、收获外泌体时机以及收获及纯化方法。这些可能才是影响实验数据的关键因素。
A
Q
赛业的原代细胞为什么提供P2，不是P0？小鼠BMSC是P6，收到需要马上实验吗？
以SD大鼠骨髓间充质干细胞举例，刚从乳鼠股骨内提取出来原代细胞，除了间充质干细胞之外，还有很多“杂细胞”，比如单核细胞，红细胞和巨噬细胞。在体外培养过程中，使用BMSC完全培养基，低比例的“杂质细胞”可被BMSC培养体系筛选去除。传到P2，BMSC所占比例就能达到95%甚至更高。如果贴壁的“杂质细胞”数量偏多形成小细胞团，还可以使用细胞刮去除。小鼠BMSC则需要多次传代才能进一步纯化，所以是P6。
另外，客户收到细胞后，建议培养稳定后，传代使用。咱们赛业提供的BMSC干性还是很高的，可以保证客户收到细胞后，再传5代都能满足实验需求。
A
Q
如何避免BMSC细胞老化问题，细胞到后期会变“胖”？
BMSC本身没有无限增殖能力，传代次数有限，随着代数增长，BMSC老化是必然的现象。但以下有几个因素会加快BMSC老化。
1.传代时机太晚，如果细胞密度过高（90%以上）再传代，BMSC容易进入平台衰退期，俗称“长太过了”。不仅是BMSC，其他细胞系，如果传代时机太晚，也容易导致细胞老化。
2.胰酶消化时间过长，BMSC的贴壁能力较弱，使用0.25%胰酶进行消化1分钟，显微镜下观察细胞间隙变大，变圆，用手轻拍培养器皿可见细胞脱落即可终止消化。如果消化时间偏长，3分钟甚至5分钟，都容易导致BMSC的老化，失去极性呈现完全塌下去的形态。
3.初始接种细胞密度过低，也容易导致细胞老化。
A
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