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龙珍 祝翔
01
样品前处理
如表1所示，HCP的前处理通常分为三类：标准酶解、去除主蛋白的酶解策略、富集HCP的前处理策略。这些前处理方法各有优缺点。通常情况下，抗体的酶解选择native酶解法，也就是在pH 7-8的缓冲溶液中加入蛋白酶直接酶切（不做变性、还原和烷基化处理）。这个方法由Huang在2017年使用到NIST Mab的HCP检测中，是一种简单有效的方法3。主要的原理是，在native条件下抗体的酶解是被限制的，而与抗体具有不同性质的HCP可以酶解得到相应的肽段，因此最终得到的酶解溶液中主蛋白的肽段浓度低于常规酶解。Native酶解和标准酶解所得肽谱对比如图1所示。除了native酶解，还有国内厂家使用磁珠法富集HCP。此外，对于非抗体类的重组蛋白，例如AAV，由于主蛋白的含量很低，native酶解并没有显著优势，可以尝试标准酶解。为了实现产品中HCP的全面检测，有必要进行多种前处理方法合并研究。
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02
分离方法
HCP样品的分离可以有多种方法，我们将这些方法的优缺点对比如表2所示。初期产品的研究，建议使用nanoLC-MS开展相关研。相对与UHPLC-MS，nanoLC-MS即使使用5 µm粒径的色谱填料，灵敏度也可以高50-200倍，如果使用亚2µm的填料，可以获得更高的灵敏度8。NanoLC-MS的高灵敏可以实现0.1 ppm HCP的检测，这样的灵敏度是常规液相（包括2DLC）无法实现的6。
表2 常见的HCP分离方法对比
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03
采集方法和分析软件
常见的采集方法如表3所示。在产品的初期，建议使用DDA或者DIA的采集方法探索样品中HCP的种类和大致含量，待产品成熟后可以转为MRM/PRM的方法对特定的HCP进行定量检测。DDA和DIA的好处是可以同时监测多种HCP的含量、包括目标和非目标HCP的检测。MRM/PRM更倾向于目标HCP的检测。可以检索DDA采集数据的软件通常比DIA更多，如mascot、Proteome Discoverer （PD）、BioPharma Finder (BPF) 、pFind等。但随着DIA的采集方法越来越成熟，可以支持DIA数据检索的软件也越来越多，例如PD、Spectronuat和DIA-NN等。需要注意的是，因为不同的软件卡值标准不同，所以检索的结果会存在差异，为了实现更为全面的HCP检索，可以将不同软件检索的结果合并分析，最后选择重点关注的HCP种类做深入研究。
表3 HCP常见的采集方法对比
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04
HCP的定量
HCP的定量可以选择三种不同的方式，如表4所示。标准蛋白添加的方式可以同时定量多种HCP，但定量的结果与标准肽段添加存在差异。标准蛋白添加的定量理论来源于Hi3原则，如公式1。得到HCP的物质的量后，可以参考公式2计算HCP的含量。
表4 HCP的定量方法
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05
报告内容
一份定性的HCP报告，需要包含HCP的种类、pI点和分子量。定量分析的HCP报告除了包含定性的内容以外，还需要报告HCP的含量，例如ppm或者物质的量。需要注意的是，因为LCMS和ELISA的检测原理不同，LCMS定量的单个HCP的含量之和与ELISA定量的HCP总量不具有换算关系。将两种方法用于HCP的定量并非是为了统一，而是互为补充，当其中任何一种方法检测得到的HCP含量高都需要继续研究。
当报告产品中没有HCP存在，需要提供检测方法的灵敏度。可以在样品中添加蛋白作为方法的灵敏度检测。用于灵敏度和HCP定量的标准蛋白，需要纯度、序列（包括修饰）和质量已知。如果报告产品中存在HCP，需要提供检测方法的carryover数据，也就是blank样品中不应该这些蛋白的检出。此外，一旦确定样品中含有HCP，需要用人为添加的方式做验证。
06
HCP概念的外延
LCMS检测重组蛋白中HCP的种类和含量的思路来源于蛋白组学。蛋白组学的研究思路不仅可以用于HCP的分析，还可以用于其它非重组生物制品，例如天然提取生物制品的蛋白组成和含量分析9、病毒类疫苗10和细菌类疫苗11的蛋白组成分析等，为这些生物制品的质量评价提供思路。
参考文献：
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